石楠藤多糖的提取及其抗氧化活性研究

覃亮，刘航博，韦宇，吴贻淋，周晓橦，戴思敏

（肇庆学院 食品与制药工程学院，广东肇庆 526061）

石楠藤为胡椒科植物毛蒟[Piper puberulum(Benth.)Maxim.]的干燥枝叶，又名爬岩香、巴岩香等，性辛，温，归肝、脾经，常用于治疗风寒湿痹、筋骨疼痛[1-2]。研究表明，石楠藤的化学成分主要有木脂素、新木脂素类、酰胺生物碱类、有机酸、甾醇类和挥发油等[3-4]。我国科研工作者对石楠藤含有的有效成分做了大量活性研究。许宝华等[5]发现，石楠藤提取物对急性出血性坏死性胰腺炎大鼠内毒素血症具有较好的防治作用。陈少奇等[6]发现，石楠藤提取物使小鼠的逃避潜伏期以及寻找平台游泳距离均出现明显地缩短（P＜0.05），明显提高AD模型小鼠的学习记忆能力，拮抗或修复Aβ25-35对小鼠学习能力的损伤。为拓展人们对石楠藤应用价值的认识，本试验将优化石楠藤多糖提取工艺，并评价其抗氧化活性，为石楠藤作为药用植物资源的进一步开发提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

石楠藤，广东清源中药饮片有限公司（批号：1952167）。

1,1-二苯基-2-苦味基肼（DPPH，C14114102）、二甲基亚砜（DMSO，C17354346），上海麦克林生化科技有限公司；石油醚、无水乙醇、葡萄糖、苯酚等，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所用水为蒸馏水。

XL-30C新型高速连续式超微粉碎机，广州市旭朗机械设备有限公司；TDL-40C低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；UV-1800型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 药材的脱脂处理

石楠藤粉末以石油醚为溶剂，索式提取法脱脂，药渣置于通风处晾干，得到脱脂石楠藤干粉，备用。

1.2.2 绘制标准曲线

吸取0.1 mg/mL葡萄糖溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL和1.4 mL，到标好序号的试管中，并用胶头滴管滴加蒸馏水到2.0 mL，使之浓度稀释为0.010 mg/mL、0.015 mg/mL、0.020 mg/mL、0.025 mg/mL、0.030 mg/mL、0.035 mg/mL和0.040 mg/mL，往试管依次滴加1.0 mL的5%苯酚溶液，轻轻振荡加摇动，小心准确地加入浓硫酸5.0 mL，静置数分钟。根据紫外分光光度法，在490 nm处记录吸光度[7]。以葡萄糖溶液的浓度X（mg/mL）为横坐标，以葡萄糖溶液的吸光度A为纵坐标，即得线性方程A=23.711X-0.1148，相关系数R2=0.999 7，可见在0.010～0.040 mg/mL范围内线性关系良好。

1.2.3 单因素试验

（1）提取温度对石楠藤多糖提取率的影响。采用水提醇沉法提取石楠藤多糖，具体工艺为：将脱脂石楠藤粉末50 g置于圆底烧瓶中，加入2 L蒸馏水，分别在50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃条件下加热搅拌提取60 min，过滤得粗多糖溶液。溶液经脱蛋白、脱色后，再次过滤，浓缩，加入无水乙醇至乙醇含量为60%，醇沉过夜，离心得粗多糖，冷冻干燥24 h，取出存好，备用。实验重复3次，多糖得率的计算如式（1）。

式（1）中，m为多糖质量，g；M为脱脂石楠藤粉末的质量，g。

（2）提取时间对石楠藤多糖提取率的影响。参考（1）的方法，料液比1∶40（g∶mL）、提取温度80 ℃，加热搅拌50 min、60 min、70 min、80 min和90 min，提取液经脱蛋白、脱色、浓缩处理后，加入无水乙醇至乙醇含量为60%，醇沉得到多糖并按式（1）计算多糖得率。

（3）料液比对石楠藤多糖提取率的影响。参考（1）的方法，提取温度80 ℃，提取时间70 min，料液比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60（g∶mL），提取液经脱蛋白、脱色、浓缩处理后，加入无水乙醇至乙醇含量为60%，醇沉得到多糖并按式（1）计算多糖得率。

（4）醇沉体积分数含量对石楠藤多糖提取率的影响。参考（1）的方法，料液比1∶50（g∶mL）、提取温度80 ℃，提取时间70 min，提取液经脱蛋白、脱色、浓缩处理后，分别加入无水乙醇至乙醇含量为50%、60%、70%、80%和90%，醇沉得到多糖并按式（1）计算多糖得率。

1.2.4 正交试验设计

根据单因素试验结果，以提取温度、提取时间、料液比和醇沉体积分数作为影响因素，设计L9（34）正交试验（见表1），每组3个平行。

表1 正交试验设计表

1.2.5 多糖抗氧化试验

将2 mL的0.2 mmol/L DPPH（溶于95%乙醇中）添加到2 mL的样品溶液中。混合均匀后在室温下避光反应15 min，在517 nm处测量上清液的吸光度，清除率计算公式如式（2）[8]。

对照用无水乙醇代替DPPH进行，无水乙醇替代样品作空白，维生素C用作阳性标准，每组实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 单因素试验分析

温度对多糖提取率的影响如图1所示，当温度达到80 ℃时，石楠藤多糖提取率达到最高，随后多糖的提取率开始下降，因此选择70 ℃、80 ℃、90 ℃作进一步优化。提取时间对多糖含量的影响如图2所示，当提取时间为60 min时，多糖提取率达到最高，随后提取率趋于平缓并有下降趋势，因此选择60 min、70 min、80 min作进一步优化。料液比对多糖含量的影响如图3所示，多糖提取率随着料液比的增大逐渐上升，当料液比达到1∶50（g ：mL）时多糖提取率达到最高，随后趋于平稳，因此选择1∶40、1∶50、1∶60（g ：mL）的料液比作进一步优化。醇沉体积分数对多糖含量的影响如图4所示，当醇沉体积分数为60%时，多糖提取率达到最高，随后提取率趋于平缓，故选择50%、60%、70%作进一步优化。

图1 提取温度对多糖含量的影响

图2 提取时间对多糖含量的影响

图3 料液比对多糖含量的影响

图4 醇沉体积分数对多糖含量的影响

2.2 正交优化多糖提取工艺

从表2可知，石楠藤多糖提取各因素影响程度依次为醇沉体积分数＞提取温度＞料液比＞提取时间，最优提取工艺为A2B2C2D3，即提取温度为80 ℃，提取时间70 min，料液比为1∶50（g ：mL），醇沉体积分数为70%。

表2 试验设计及结果

2.3 验证试验

为验证工艺的稳定性，按照优化的工艺平行提取3次，多糖提取率分别为5.38%、5.40%、5.36%，工艺稳定性良好。

2.4 多糖抗氧化试验

试验结果表明（图5），当多糖质量浓度为0.2～5.0 mg/mL时，石楠藤多糖对DPPH·的清除率随着多糖浓度的增加而增加，半最大效应浓度（EC50）为0.801 mg/mL。

图5 多糖对DPPH·清除率的影响

3 结论

本文对石楠藤多糖进行了研究，通过正交试验确定了最优提取工艺，即提取温度为80 ℃、提取时间70 min、料液比为1∶50（g ：mL）、醇沉体积分数为70%。深入研究发现，石楠藤多糖对DPPH·表现出较好的清除效果，EC50为0.801 mg/mL。石楠藤作为广东地区常见的一味中药材，许多有效成分尚未被人发现，本文对其多糖的提取和抗氧化活性进行了初步研究，为石楠藤资源的深入研究提供了实验基础。