黄芪多糖通过JAK2/STAT3通路调控人膝骨关节炎软骨细胞增殖与凋亡

高伟静 林朋朝

骨关节炎是一种多发于中老年的慢性骨关节病，以关节软骨硬化增生、进行性退变等为主要临床表现，其致残率居世界疾病谱第4位，严重危害人类的生命健康和生活质量[1]。骨关节炎好发于髋、膝、手等关节，以膝骨关节炎最为多见。骨关节炎病理机制复杂，其中软骨细胞增殖障碍与过度凋亡在其进展过程中发挥着重要作用[2,3]。目前，临床上对骨关节炎主要采用非甾体药物抗炎、关节腔穿刺注射骨保护剂等对症治疗，虽能改善症状，但不能抑制骨关节炎进展，并且容易引发消化不良、出血等并发症[4,5]。

黄芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)是中药黄芪的主要活性成分，由葡聚糖、葡萄糖、鼠李糖等组成，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等药理学作用[6～8]。Janus激酶2(janus kinase 2，JAK2)/信号转导与转录激活因子3(aignal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通路参与细胞增殖与凋亡的调控，在骨关节炎软骨细胞增殖与凋亡过程中发挥着重要调控作用[9]。研究发现，APS能够通过JAK2/STAT3通路调控肾小管上皮细胞、口腔鳞癌细胞增殖与凋亡[10,11]。本研究旨在探讨APS对人膝骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡以及JAK2/STAT3信号通路的影响，现报道如下。

材料与方法

1.材料：(1)细胞：取严重膝骨关节炎并行膝关节置换术患者的膝关节软骨组织，剪碎后滴加0.25%胰酶、2%Ⅱ型胶原酶后置37℃、5% CO2细胞培养箱中消化10h，4℃ 2000r/min离心(半径8cm)5min取沉淀，DMEM培养基冲洗后再离心取沉淀，如此重复3次，即为膝骨关节炎软骨细胞。本研究经笔者医院医学伦理学委员会批准(伦理审批号：2020-SJZSY-KY-004)。(2)药物与试剂：APS购自陕西慧科植物开发有限公司；MTT试剂盒购自美国Amresco公司；PI、Annexin V-FITC/PI试剂盒购自美国BD公司；BCA、ECL购自北京索莱宝科技有限公司；兔源JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、p21、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin抗体和羊抗兔IgG二抗购自北京博奥森生物技术有限公司。

2.分组与给药：取对数生长期人膝骨关节炎软骨细胞，设空白对照组，APS低、中、高剂量组和塞来昔布组。空白对照组接种于常规DMEM培养基；APS低、中、高剂量组分别接种于含终浓度25、50、100mg/L APS的DMEM培养基[12]；塞来昔布组接种于含终浓度20mg/L塞来昔布的DMEM培养基，48h后检测各指标[13]。

3.MTT法检测细胞增殖活力：各组细胞经0.25%胰酶消化后收集细胞，制备浓度6×105个/毫升的单细胞悬液，100微升/孔接种于96孔培养板，各组均设10个复孔。20微升/孔加入5mg/ml的 MTT溶液，继续培养4h后收集细胞，200微升/孔加入DMSO 37℃避光孵育10min后，通过酶标仪检测490nm波长处吸光度(A)值，细胞增殖活力(%)=[(A药物组-A调零组)/(A空白对照组-A调零组)]×100%。

4.Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平：各组细胞经不含EDTA的胰蛋白酶消化后收集细胞，遵照Annexin V-FITC/PI试剂盒操作说明，加入结合缓冲液重悬细胞后，滴加Annexin V-FITC和PI染液37℃避光孵育15min，然后通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

5.PI染色法检测细胞周期分布：每组取10个复孔，经0.25%胰酶消化后收集细胞，75%的乙醇溶液固定12h，滴加PI溶液避光孵育30min后，通过流式细胞仪检测细胞周期(G0/G1期、S期、G2/M期)分布。

6.Western blot法检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、p21、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达：每组取10个复孔，经0.25%胰酶消化后收集细胞，加RIPA裂解液置于冰上裂解30min，4℃、12000r/min离心(半径8cm)20min取上清液，BCA法检测总蛋白浓度、沸水浴10min使蛋白变性后，SDS-PAGE电泳分离蛋白、湿转法转PVDF膜、5%脱脂奶粉室温封闭2h后，滴加目标蛋白和β-actin一抗后4℃孵育过夜，洗膜后滴加IgG二抗室温孵育1.5h，洗膜后滴加ECL显色，以目标蛋白与内参(β-actin)条带灰度值的比值作为目标蛋白相对表达量。

结 果

1.APS对人膝骨关节炎软骨细胞增殖活力和凋亡的影响：与空白对照组比较，APS中、高剂量组和塞来昔布组细胞增殖活力显著升高、凋亡率显著降低(P<0.01)；与塞来昔布组比较，APS高剂量组细胞增殖活力显著升高、凋亡率显著降低(P<0.05),详见表1、图1。

表1 APS对人膝骨关节炎软骨细胞增殖活力和凋亡率的影响

图1 APS对人膝骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

2.APS对人膝骨关节炎软骨细胞周期分布的影响：与空白对照组比较，APS中、高剂量组和塞来昔布组处于G0/G1期细胞比例显著降低、S期细胞比例显著升高(P<0.05)；与塞来昔布组比较，APS高剂量组处于G0/G1期细胞比例显著降低、S期细胞比例显著升高(P<0.01)，详见图2、表2。

表2 APS对人膝骨关节炎软骨细胞周期分布的影响

图2 APS对人膝骨关节炎软骨细胞周期分布的影响

3.APS对人膝骨关节炎软骨细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响：与空白对照组比较，APS中、高剂量组和塞来昔布组p-JAK2、p-STAT3表达明显上调(P<0.01)，JAK2、STAT3表达差异无统计学意义(P>0.05)，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值显著升高(P<0.01)；与塞来昔布组比较，APS高剂量组p-JAK2、p-STAT3表达明显上调(P<0.01)，JAK2、STAT3表达差异无统计学意义(P>0.05)，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值显著升高(P<0.01)，详见图3、表3。

表3 APS对人膝骨关节炎软骨细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值的影响

图3 APS对人膝骨关节炎软骨细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响

4.APS对人膝骨关节炎软骨细胞cyclin D1、p21、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响：与空白对照组比较，APS中、高剂量组和塞来昔布组cyclin D1、Bcl-2表达明显上调而p21、cleaved caspase-3、Bax表达明显下调(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.01)；与塞来昔布组比较，APS高剂量组cyclin D1表达明显上调且p21、cleaved caspase-3、Bax表达明显下调(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.01),详见图4、表4。

表4 APS对人膝骨关节炎软骨细胞cyclin D1、p21、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax相对表达量及Bcl-2/Bax比值的影响

图4 APS对人膝骨关节炎软骨细胞cyclin D1、p21、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

讨 论

细胞增殖与凋亡过程均有多种蛋白参与调控。cyclin D1能够激活周期素依赖性蛋白激酶(CDK)并诱导转录因子E2F表达，CDK和转录因子E2F则能够促使细胞周期由G1期进入S期，从而缩短细胞周期、促进细胞增殖[14]。p21是CDK抑制剂，能够与CDK形成p21-CDK复合物而抑制其活性，进而起到阻滞细胞周期进程的作用[15]。cleaved caspase-3能够刺激启动细胞凋亡并参与细胞凋亡执行过程。Bax能够诱导细胞色素C(Cyt C)释放，Cyt C则能够剪切活化caspase-3而间接促进细胞凋亡；Bcl-2能够抑制Cyt C释放，能够与Bax形成二聚体而抑制Bax活性，表现为抑细胞凋亡作用，Bcl-2/Bax比值能够反映二者对细胞凋亡的调控作用[16]。本研究发现，经APS干预能够明显提高人膝骨关节炎软骨细胞增殖活力并降低凋亡率；明显提高处于G0/G1期细胞比例，上调cyclin D1、Bcl-2表达并下调p21、cleaved caspase-3、Bax表达，提高Bcl-2/Bax比值，这可能是APS促进人膝骨关节炎软骨细胞增殖并抑制其凋亡的重要分子机制。

JAK是一类酪氨酸蛋白激酶，包括JAK1、JAK2、JAK3 3种亚型，其中JAK2介导配体和受体间信号的转导；STAT蛋白有7种亚型，其中STAT3为JAK2的下游基因，能够被p-JAK2诱导表达和磷酸化活化[17]。p-STAT3则能够诱导cyclin D1、Bcl-2表达，因此JAK2/STAT3通路参与细胞增殖与凋亡过程的调控[18]。本研究发现，APS干预能够明显上调人膝骨关节炎软骨细胞p-JAK2、p-STAT3表达，提高p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值，提示APS能够激活JAK2/ STAT3通路。

综上所述，APS具有促进人膝骨关节炎软骨细胞增殖并抑制其凋亡的作用，其机制可能与激活JAK2/ STAT3通路有关。本研究结果为APS做为膝骨关节炎治疗备选药物提供了理论支持。