锶对磷酸镁骨水泥理化性质及成骨活性影响的研究

邱永龙，施玉博，李威，龚长天，郭卫春

(武汉大学人民医院骨科，武汉 430060)

骨缺损修复是目前骨科临床面临的巨大挑战之一[1]。自体骨由于可避免免疫排斥及潜在的传播疾病风险等一系列问题，而一直被视为临床上治疗骨缺损的“金标准”[2]。然而，自体骨的来源有限且常给患者带来“二次手术”的痛苦，对于大块骨缺损常不能很好地解决问题，但作为自体骨替代物之一的同种异体骨通常价格较为昂贵。且有研究发现，同种异体骨的移植有较大可能产生免疫排斥及传播疾病，从而产生骨缺损以外的机体损伤[3]。在自体骨和同种异体骨应用受限的情况下，寻找一种力学性质稳定、生物学性能优异的人工骨替代品成为目前众多学者主要的研究方向之一。

聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)骨水泥作为较早投入临床使用的骨水泥，具有凝固迅速、力学强度高等优点；但PMMA骨水泥在凝固过程中放热剧烈、峰值温度较高，会对周围组织造成一定的损伤[4]。同时PMMA骨水泥的生物学性能较差，且单体具有一定的生物毒性[5]。另外，几乎不降解的PMMA骨水泥长期存在于骨缺损处，极大影响了新生骨的长入而不利于骨组织的修复。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)作为一种与人体骨成分类似的人工骨替代品，其生物学性能、降解性、力学性质及凝固速度可以通过添加物进行有效地改善[6-7]，但是它的初始力学性能差、降解缓慢及成骨活性差等一些劣势极大的限制了它的临床应用及推广。

由于PMMA骨水泥和CPC均存在一定的缺陷，具有明显优势的磷酸镁骨水泥(magnesium phosphate cements，MPC)成为目前骨修复材料领域研究的新方向。MPC在具有优良的力学性能的同时，兼具更为突出的生物学性能和降解性能[8]。具体体现在MPC能够促进成骨细胞等细胞在材料表面黏附增殖。此外，MPC的降解性能优于PMMA骨水泥和CPC，可以在更短的时间内降解，以解除人工骨替代品的占位，更有利于血管长入和新骨生成[9]。但MPC作为一种新型骨修复材料，其生物学性能的研究尚不完全，且单一MPC的成骨活性常难以满足目前临床上的要求。目前针对MPC不足之处的主要改进方法有改善煅烧工艺，以及通过添加一种或多种具有一定良好性质的无机物或者有机物等。

锶(Sr)作为一种广泛存在于人体各个部位组织中的微量元素，其生理功能与骨骼形成密切相关[10]。Sr具有促进前成骨细胞增殖、骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化、骨基质矿化以及抑制破骨细胞分化等作用[11]。目前已有众多研究证实，Sr可以通过下调Wnt抑制剂硬骨素的表达，进一步增强下游β-Catenin信号的转导；使细胞内促成骨因子表达增多，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨涎蛋白和骨钙素等高表达，进而促进成骨细胞成熟分化及促进骨形成[12]。因此，为了进一步改进MPC的成骨能力，本研究考虑通过添加Sr对MPC进行改性，研究Sr-MPC性质的改良及其对动物模型骨缺损修复的影响，以期制备一种性能更加优越的新型骨修复材料。

1 材料与方法

1.1 掺锶MPC的制备方法 Sr-MPC的固相由磷酸二氢钾、重烧后的氧化镁和氧化锶组成，其中磷酸二氢钾与氧化镁的摩尔比为1︰1.5。采用球磨机对固相中各成分分别进行研磨，通过200目筛筛分，得到粒径约75 μm的颗粒。氧化锶按照占固相质量百分数分别添加2%、4%、6%和8%，将混合后的固相粉末按照2 g/mL的固液比与去离子水充分混合，搅拌成均匀的膏体，分别灌注到直径6 mm、高度12mm的圆柱形模具进行物化性能测试和直径6 mm、厚度1 mm的圆盘模具进行生物性能测试。所有样品在37℃和100%相对湿度的烘箱中烘烤72 h，硬化后在121℃和1.21 MPa的湿热条件下灭菌30 min。MPC作为对照。具体制备比例及命名见表1。

表1 磷酸镁骨水泥及锶/磷酸镁复合骨水泥的配方

1.2 凝固时间、放热温度、力学强度和体外降解率 根据中国国家标准，凝固时间的定义为维卡仪针头无法穿透样品1 mm时所花费的时间。放热温度使用温度传感器测量，温度传感器放置在水泥膏体中间，并将膏体置于聚苯乙烯模具中保温。样品的抗压强度按照英国标准局提出的标准，在加载速率为1 mm/min时，采用通用试验机进行测量。体外降解率测量方法为将样品浸泡于生理盐水之中，生理盐水与样品的比例为2 mL/g，样本在第1天、第3天、第5天、第7天、第14天、第21天和第28天分别清洗、烘干，减重率按烘干后重量占初始重量的百分比计算。每组3个独立样本，取结果均值。

1.3 材料表面形貌和细胞电镜 采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)观察骨水泥样品表面的形貌和细胞形态。骨水泥材料烘箱干燥后喷金，在SEM下观察材料表面形貌。细胞电镜则需要骨水泥材料与MC3T3-E1成骨前细胞共培养，培养7 d后磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗材料3遍，在4%多聚甲醛溶液中固定15 min，梯度脱水，烘箱干燥后喷金，在SEM下观察材料表面细胞形态。

1.4 细胞增殖 MC3T3-E1成骨前细胞用于评估不同材料样品上的细胞增殖情况。细胞培养于5% CO2、37℃的培养箱中，培养基配方为90% α-MEM，10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。所有样品灭菌后置于6孔板中，在细胞种植前用培养基预培养。然后以1×104的密度将细胞接种于所有样品表面，培养1、3、5 d，每3天更换新鲜培养基。在指定时间点，每孔加100 μL PBS冲洗，重复3次。每孔加入10 μL细胞计数试剂(cell counting kit-8，CCK-8)溶液，37℃孵育2 h。最后将100 μL培养物转移到96孔板上，在450 nm处用酶标仪测定光密度(optical density，OD)。

1.5 ALP活性测定 用对硝基苯基磷酸盐(p-nitrophenyl phosphate，pNPP)测定ALP活性。将样品置于6孔板，种植MC3T3-E1细胞。细胞孵育7 d、14 d后，PBS洗涤2次，用裂解缓冲液裂解，随后将样品液转移至96孔板中，再加入pNPP底物溶液。样品在室温黑暗中孵育30 min，用酶标仪在405 nm处测定吸光度。根据标准曲线计算不同样品中的ALP活性。

1.6 成骨相关基因表达测定 采用实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测成骨相关基因的表达情况。具体方法为，用TRIzol法提取总RNA，用RevertAidTM第一链互补DNA(complementary DNA，cDNA)合成试剂盒合成cDNA。采用ABI PRISM 7900HT快速序列检测系统进行实时PCR检测。骨形成相关基因，包括骨钙素(osteocalcin，OC)和Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)的表达采用2-ΔΔCt方法归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)。引物序列见表2。

表2 PCR实验中的引物序列

1.7 动物实验 动物实验经武汉大学人民医院临床伦理审查委员会审核通过。基于前期对材料理化性质的测定及细胞实验结果，认为Sr-MPC-8组最为优异，故选择Sr-MPC-8组作为实验组进行动物实验，MPC组作为对照组。将10只Sprague-Dawley大鼠随机分为两组：MPC组和Sr-MPC-8组，每组5只。通过腹腔注射50 mg/kg 氯胺酮和10 mg/kg甲苯噻嗪混合物麻醉大鼠。麻醉成功后，剃光头部被毛并用碘伏消毒。沿正中线矢状切开3 cm，分离软组织和骨膜，显露双侧顶骨、部分枕骨和额骨。然后，使用牙钻在双侧顶骨创建2个全厚度骨缺损(直径6mm)，将MPC和Sr-MPC-8样本放入缺损处后，用可吸收缝合线缝合骨膜组织和皮肤。大鼠饲养1个月后处死，取顶骨分析，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。切片机切割组织切片(10 μm)，进行苏木素-伊红染色(HE染色)。

2 结 果

2.1 凝固时间和放热温度 图1a可见，与MPC组相比较，随着氧化锶添加比例的上升，Sr-MPC的凝固时间有所延长，但Sr-MPC-2、Sr-MPC-4、Sr-MPC-6三组之间未见明显的差异，Sr-MPC-8组较MPC组凝固时间延长，差异有统计学意义(P<0.05)。认为氧化锶的添加比例对于骨水泥的凝固时间有一定的影响，8%氧化锶的加入一定程度上延长了新型骨水泥的凝固时间，这可能与氧化锶的加入延缓了氧化镁的溶解有关，一定程度上延缓了MPC的水和反应。图1b可见，与MPC组相比较，随着氧化锶添加比例的上升，骨水泥材料的放热温度呈现上升趋势，与Sr-MPC-4、Sr-MPC-6、Sr-MPC-8三组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果提示这可能与氧化锶的添加比例有关，氧化锶的添加比例为2%时，对本身MPC的水和反应放热影响不大，其差异并无统计学意义。但当添加比例进一步上升，添加比例达到4%、6%和8%时，考虑氧化锶与液相去离子水反应产生碱性的氢氧化锶，本质上也参与了酸碱中和反应，因此也会放出一定的热量，这使得骨水泥材料的放热温度有所上升。但总体来看，温度上升的幅度并不大。

a 凝固时间 b 放热温度

2.2 力学强度与体外降解率 图2a可见，与MPC组相比较，随着氧化锶添加比例的上升，骨水泥材料的力学强度呈现上升趋势，与Sr-MPC-4、Sr-MPC-6、Sr-MPC-8三组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与第3天和第5天时Sr-MPC-2组比较，差异也具有统计学意义(P<0.05)。结果可见骨水泥材料的强度会受到添加物比例的影响，力学强度的上升可能与添加物影响了MPC自身的水和反应有关，氧化锶的加入影响了氧化镁与磷酸二氢盐的水和反应，影响了KMgPO4·6H2O晶体的生成，锶可能参与了KMgPO4·6H2O晶体裂隙的填补与部分替换，使得晶体排列更为致密，因此对材料的力学强度产生了一定的影响。图2b可见，与MPC组相比较，随着氧化锶添加比例的上升，骨水泥材料的体外降解率呈现下降趋势，其中Sr-MPC-8的体外降解率有明显的降低，这可能与氧化锶的加入提高了材料的力学强度有关，锶元素的填补使得晶体排列更为致密，一定程度上延缓了Sr-MPC的体外降解。

a 力学强度 b 体外降解率

2.3 材料表面形貌 与MPC组相比较，随着氧化锶添加比例的上升，电镜下骨水泥材料的表面形貌表现出一定的差异，具体表现为Sr-MPC表面颗粒感更加显著。MPC组电镜下可见较多裂痕，晶体排列较为疏松，而Sr-MPC表面则表现为颗粒状的细小晶体，排列较为致密，考虑为氧化锶的添加影响了KMgPO4·6H2O晶体的生成，锶元素填补了KMgPO4·6H2O晶体之间的裂隙，使微观结构变得致密，因此对材料的表面形貌产生了一定的影响(见图3)。

图3 各组扫描电镜下材料的表面形貌

2.4 细胞增殖 由图4可见，与MPC组相比较，随着氧化锶添加比例的上升，添加氧化锶的骨水泥组其OD值表现为上升趋势，第1天Sr-MPC-8组与MPC组有具有统计学意义的差异(P<0.05)，而第3天和第5天时，各组与MPC组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。可见氧化锶的加入，对于成骨细胞的增殖有较为明显的促进作用，且随着氧化锶比例的增加，这种促进作用也在随之增加，Sr-MPC-8组表现最为显著。

2.5 ALP活性测定 与MPC组相比较，随着氧化锶添加比例的上升，添加氧化锶的骨水泥组其ALP的活性有较为显著的上升，且各组之间差异明显。ALP作为成骨细胞的表型标志物之一，可以直接反映成骨细胞的活性及功能状况。实验结果表明，随着氧化锶添加比例的上升，与材料共培养的成骨细胞其ALP活性越高，以Sr-MPC-8组最为显著。这进一步表明，锶元素对于成骨有着良好的促进作用(见图5)。

注：*与MPC组比较，P<0.05 注：*与MPC组比较，P<0.05

2.6 成骨相关基因表达 与MPC组相比较，随着氧化锶添加比例的上升，添加氧化锶的骨水泥组其OC与RUNX2的基因表达有较为明显的升高(见图6)。OC与RUNX2的表达上升反映出锶元素对于成骨相关基因的表达起着促进作用。这也表明，锶元素作为成骨相关的一种影响因子，它能够促进MC3T3-E1成骨前细胞进一步向成骨方向分化。

2.7 细胞电镜 通过物化性能的比较及相关生化实验的结果，我们发现锶的加入对于成骨细胞的增殖和分化有较好的

a OC基因表达量 b RUNX2基因表达量

促进作用，以Sr-MPC-8组的结果最优。因此，我们选取对照组MPC和最优组Sr-MPC-8组，在材料上种植MC3T3-E1成骨前细胞，培养7 d后扫描电镜下观察。MPC组电镜图显示，黏附的MC3T3-E1成骨前细胞数量少，且伪足较少；而Sr-MPC-8组其电镜图上黏附的MC3T3-E1成骨前细胞数量多，且伪足较多，延展佳，明显具备更好的黏附性(见图7)。考虑这与锶元素促进成骨前细胞成骨相关基因的表达有关，例如黏着斑的表达等使细胞更好地黏附于材料表面，因此导致在电镜下细胞形态产生一定的差异。

图7 两组电镜下材料表面细胞图

2.8 HE染色 选取1个月后大鼠顶骨骨缺损模型制成HE染色切片。与MPC组相比较，Sr-MPC-8组HE染色可见骨缺损处骨折愈合线更加完整、致密，有更多的新骨生成。这与锶元素本身就是作为成骨相关的影响因子有关，锶元素促进成骨表达，因此加速了骨缺损的修复。说明添加氧化锶的新型MPC可以促进体内骨缺损的修复，加快体内新骨的生成(见图8)。

图8 大鼠顶骨骨缺损模型染色结果(HE，×40)

3 讨 论

MPC作为一种新型人工骨替代材料，近年来对其研究备受人们关注。MPC由于其出色的特性，有望成为一种超越PMMA骨水泥和CPC的新型骨替代物。但单纯MPC仍存在一定的不足之处，这使得对于MPC的改性成为人们研究的重点及热点方向[13]。临床上对于人工骨替代品的要求，主要集中于减少免疫排斥反应和促进新骨的形成。尤其是人工骨替代品对于新骨形成的促进作用，是目前众多专家研究的主要方向[14]。

本研究通过对锶元素的学习和早期对磷酸镁骨水泥的探索，考虑通过添加锶对MPC进行改性，研究Sr-MPC性质的改良及其对体内骨缺损修复的影响。研究中，制备添加不同比例氧化锶的MPC，以MPC作为对照组，Sr-MPC为实验组，探究新型MPC对骨缺损的修复影响。

适宜的凝固时间及降解率、适当的机械强度等理化性质是骨水泥材料必备条件之一。该研究发现，Sr-MPC组的凝固时间随着氧化锶比例的上升而有所延长；这可能与氧化锶的加入延缓了氧化镁的溶解有关，一定程度上延缓了MPC的水和反应，进而延长了新型MPC的凝固时间。在放热温度的测量中，我们发现该复合材料的放热温度随着氧化锶添加比例的上升而随之上升，这是由于该反应的产热实质上为酸碱中和反应放热[15]，而氧化锶与液相去离子水反应生成的氢氧化锶可以与酸性磷酸二氢盐反应放热，使材料的放热温度上升。研究发现，氧化锶的加入一定程度上影响了KMgPO4·6H2O晶体的生成，锶元素通过填补KMgPO4·6H2O晶体之间的裂隙使晶体的排列更为致密[16]；在电镜下可以清楚地观察到MPC组骨水泥材料存在较多的裂痕、晶体排列较为疏松，而新型MPC材料表面则簇集着颗粒状的细小晶体，排列较为致密。根据此前MPC的研究，KMgPO4·6H2O晶体是影响MPC力学性能的微观基础[17]，KMgPO4·6H2O晶体之间的裂隙被锶元素有效填补，是导致添加氧化锶的骨水泥材料力学性能增强的主要原因之一。同时，由于KMgPO4·6H2O晶体之间的裂隙被锶元素有效填补，骨水泥的力学性能得以加强，微观上晶体排列更加致密，使得材料的体外降解性能表现出了下降的趋势。

良好的成骨作用是目前学者们对新型骨水泥的一个重要考量指标。该实验发现Sr-MPC在成骨细胞黏附、增殖和分化层面也表现出良好的促进作用。通过测量OD值发现，与MPC组相比较，新型MPC材料组其细胞数量明显增多；通过电镜观察发现在新型MPC材料表面MC3T3-E1成骨前细胞数量更多且拥有更多地伪足，并且可以观察到细胞在材料表面具有更佳的延伸性。另外，可直接反映成骨细胞的活性及功能状况的表型标志物之一ALP，在新型MPC材料组有着更高的表达[18]。同时，成骨相关基因也在新型MPC材料组有着更高的表达。细胞实验结果表明，新型MPC材料能够更好地促进MC3T3-E1成骨前细胞向成骨方向进一步转化，同时也可以促进成骨基因表达。大鼠顶骨骨缺损模型动物实验进一步证实新型MPC可以促进体内骨缺损的修复与新骨的生成。

研究发现，新型MPC材料与单纯MPC相比较，其理化性质有一定程度地提升，而它在生物学性能上的提升更为显著。这种新型MPC材料能够促进MC3T3-E1成骨前细胞更好地黏附、增殖及分化，可以促进大鼠体内骨缺损的修复，有利于新骨的形成，有望成为一种理想的人工骨替代材料。

综上所述，本研究证实了可以通过添加氧化锶来对MPC进行改性，且该新型骨水泥的理化性能和生物学性能均有所改善。添加8%质量分数氧化锶的MPC材料在力学性能及生物学性能方面的提升最为显著，主要表现在微观结构更致密及力学强度更高，同时也显著的促进成骨细胞成熟分化及骨的形成。动物实验结果再次验证了该新型含锶MPC对大块骨缺损的修复功能，故该实验对于MPC改性策略及大块骨缺损修复等方面的研究提供了一条新的思路并具备有一定的潜在价值。然而该实验目前仅仅停留在实验室及动物实验水平，后期还需要大量的研究才可能应用于临床。