阻塞型睡眠呼吸暂停综合征动物模型猪的建立

吴茜 李莉 李红蔚 李建国 华静娜 王星 张东

孙祥军 王程

参考文献

阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)是一种非常普遍的是一种慢性睡眠障碍疾病，可能导致心血管疾病、高血压、瘫痪和身体机能恶化，并影响患者生活质量[1]，根据年龄和性别不同，在一般人群中发病率为3%至17%[2]。此外，OSA与肥胖密切相关，在过去的20年里，由于肥胖症的流行，OSA的患病率大幅上升，超过60%的OSA患者存在肥胖。迄今为止国内外尚缺乏理想的、接近于临床病理状态的动物模型，导致其发病机制和病理生理机制研究滞后。目前常以低氧或直接在气管内造成阻塞建立OSA模型，绕过了造成人类OSAS最重要的部位-上气道。目前尚未见上气道阻塞合并肥胖的OSA模型报道。本研究探索建立肥胖因素相关的有上气道阻塞的OSA动物模型，为OSA的研究提供更符合其病理生理学特点的研究工具。

资料与方法

一、 实验动物

巴马猪1头，购自天津市百农实验动物繁育科技有限公司，雄性，体重36kg。分早、中、晚三次给予全价饲料(天津名门动物食品有限公司提供)，自由饮水，饲养温度18～26℃，湿度10%～80%。本研究经过本医院伦理委员会批准，批准号：2019-HHXT-020。

二、 仪器

电子支气管镜(安保股份有限公司Ambu A/S aScope3，型号：403001000)；CT(联影CT960+)；生命体征监护仪(GE Healthcare Finland Oy Kuortaneenkatu 2, Fi-00510 Helsinkin, Finland，型号：B20i)。

三、 试剂

盐酸塞拉嗪注射液(长沙拜特生物科技研究所有限公司)；丙泊酚注射液(四川国瑞药业有限公司)；咪达唑仑注射液(江苏恩华药业股份有限公司)；碘普罗胺造影剂300(拜耳公司)。

四、 方法

1 肥胖模型的制作:给予巴马猪全价饲料喂养，每天自由饮食。

2 阻塞性睡眠呼吸暂停模型的制作:实验动物猪饲养肥胖后进行该操作。手术当天早晨禁食、禁水，测定体重。给予速眠新和米达唑仑以1 ∶1 0.5 mL/kg进行肌肉注射诱导麻醉。成功麻醉后建立耳缘静脉通路，静脉间断推注丙泊酚用于术中维持麻醉。麻醉后将动物呈仰卧位，固定四肢，予脉搏、血氧饱和度监护。电子支气管镜经猪鼻腔进镜，观察猪声门上及口腔各结构满意(图2)，使用TBNA穿刺针分别于软腭及两侧颚咽弓处注射生理盐水与碘普罗胺造影剂混合物7.5 mL(图3)，气管镜观察双侧颚咽弓隆起满意(图4)，镜下可见猪咽腔变窄，术中密切观察动物状态，防止窒息。

五、 观察指标

观察巴马猪的外形，测量体重，计算肥胖指数。观察实验动物猪睡眠过程中呼吸暂停和低通气的次数。电子计算机断层扫描CT观察颈部局部组织影像学改变。

结 果

一、 临床结果

喂养3个月后，实验动物猪体重增至68kg(图1)。猪外形肥胖，颈围粗，体重指数达到40kg/m2，睡眠过程中出现鼾声及血氧饱和度下降，给予盐水注射后鼾声逐渐加重，偶可观察到呼吸暂停。有明显的血氧饱和度下降，最低时血氧饱和度为84%。检测猪睡眠过程中睡眠呼吸暂停低通气指数(apnea hypopnea index, AHI)为≥5次/h。

二、 影像学结果

在颈部注射生理盐水4小时后应用支气管镜于实验动物猪声门上方注射生理盐水后进行颈部CT扫描，生理盐水注射4小时后颈部CT证实可见实验动物猪咽腔内可见到不规则环状阴影，咽部狭窄(图4)。提示有气道结构变化，局部气道狭窄。

图1 饲养后体型肥胖的实验猪 图2 正常声门上结构 图3 声门上方注射生理盐水后 图4 咽腔可见不规则环状影

讨 论

阻塞性睡眠呼吸暂停是一种复杂的疾病，由多种因素引起，包括上呼吸道解剖结构改变、肥胖等。阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)影响了高达20%的人群，随着肥胖达到流行病的比例，其患病率也在增加。大量研究表明，肥胖是OSA的重要危险因素，体重变化与OSA严重程度[3]有关。从病理生理角度来看，OSA的特征为睡眠高阻力性呼吸，导致呼吸暂停及呼吸不足，高阻力的形成归结为上气道解剖学狭窄和咽部肌肉功能异常。上气道解剖易感性是导致咽塌陷发生的关键因素之一，由此引起OSA的解剖因素包括上气道狭窄和肥胖[4-8]。肥胖会导致睡眠时的咽部塌陷，这是一个众所周知的危险因素[3]。肥胖OSA患者软腭脂肪沉积较多。阻塞性睡眠呼吸暂停患者的咽脂肪垫面积较大[4]。肥胖OSA患者的舌底也可以观察到舌头体积增大，脂肪沉积增多[5]。中央型肥胖也可导致上呼吸道的解剖易感性OSA。腹部脂肪组织的积聚减少了肺体积。 基于上气道解剖易感性，自发性阻塞性睡眠呼吸暂停在几种动物中已被证实。英国斗牛犬的大软腭导致上呼吸道狭窄，是最早的动物模型之一，与人类OSA[6]相似。牛头犬的OSA主要出现在快速眼动睡眠中，与肥胖无关。相比之下，尤卡坦迷你猪则出现与肥胖相关的OSA[3]。

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OSA常见诱因是上气道阻塞，可自发及外界诱因引起。既往文献报道超过60%的OSA患者有肥胖，患者可见咽部结构(即舌根、软腭和咽壁)周围积聚脂肪组织，局部脂肪组织多导致上气道狭窄、组织性质改变、临界压力增加、静息肺容量减少，最终导致低氧血症和代谢激素改变[9]。另一方面，OSA也可能加速体重增加，因为在OSA中经常看到的睡眠碎片与瘦素下降和胃饥饿素水平增加有关[10]。因此，OSA与肥胖具有相似的病理生理机制，可能相互作用并相互增强。既往OSA动物模型的方法多以低氧方式诱导建立。具体方法为将小型猪放入低氧仓，模拟缺氧的机制，但这种方法不能模拟出OSA患者实际的血氧波动情况。此外，也有通过人工气道狭窄的方式建立OSA模型，多采用注射凝胶、安装计算机控制的活塞等方法造成上气道狭窄，模拟OSA患者气道和血氧波动的情况。但凝胶制作模型的方法有其缺陷，局部凝胶量的控制较为困难，相对不可逆，模型质控困难，一致性不能得到良好控制。

本研究在预实验过程中尝试通过支气管镜注射凝胶于声门上的方法来制作OSA模型，但在实验过程中反复尝试，凝胶在通过支气管镜的过程中即凝固，不能到达预计的注射部位。因此，本课题组调整造模方案为先诱导肥胖OSA模型，模拟肥胖相关OSA。进而联合声门上注射生理盐水的方法造成上气道狭窄，制造动物上气道的狭窄，所建立的动物模型与OSA的自然病理状态比较相符，具有稳定、可靠、重复性好的特点。避免了既往一些模型建立中采用单纯采用低氧方式诱导OSA模型，忽略了阻塞性 OSAHS 最重要的部位，即上气道在OSA的重要作用。本研究中的实验动物猪模型更加符合OSAHS 的自然病理状态，为研究肥胖相关OSA的理想大型动物模型。

OSA动物模型目前尚无公认的评价标准， 动物模型与人类OSA疾病特征是否相符最为重要。主要的观察指标包括所建立的动物模型是否具有鼻鼾、呼吸暂停、睡眠紊乱等OSA的症状；咽部解剖结构是否出现咽壁软组织增厚、咽腔的径线是否改变；是否有呼吸紊乱。本实验结果显示实验动物在OSA造模过程中出现的症状和观察指标符合OSA临床和影像学特征。本研究的创新之处在于联合肥胖及上气道阻塞两种方法进行造模，更加贴近动物和人体上气道OSA的病理生理改变，造模方法具有操作简单，可重复性高的特点，为今后OSA模型的进一步研究提供了一种新的安全有效、可行的方法。

由于本方法建立OSA模型为探索性研究，存在一定的局限性。咽部注射生理盐水造成的上气道狭窄的持续时间可能不够长，一定时间后生理盐水吸收后，其导致的局部阻塞效应会减轻消失，可能更加适合用于短期的的OSA研究，在此基础上建立稳定的OSA模型，值得进一步探索。本研究在肥胖的基础上制造上气道狭窄，为OSA动物模型的制作提供了一个新的思路。