空心泡组织培养及快速繁殖

杨鼎元 陈哲 官纪元 沈玺龙 李永霞 张群英

摘 要：以空心泡（Rubus resaefolius）带腋芽茎段为外植体，建立快繁体系，筛选出最佳外植体并灭菌处理，探寻6-BA、IBA、NAA3种生长调节剂对空心泡不定芽的诱导情况。以3种调节剂的单因素试验为基础，设计正交试验，筛选最佳的继代培养生长调节剂组合。结果表明：以75%酒精灭菌30S结合0.1%升汞处理7min的外植体成活率最高，为80.78%;污染率为15.44%。6-BA浓度为0.6mg·L-1时，增殖系数最高，为8.07;IBA浓度为0.02mg·L-1时，增殖系数最高，为7.03;NAA浓度为0.02mg·L-1时，增殖系数最高，为6.87。3种生长调节剂联合使用时，在6-BA浓度为0.6mg·L-1、IBA浓度为0.06mg·L-1、NAA浓度为0.02mg·L-1时获得空心泡外植体的增殖系数最高。

关键词：空心泡;组织培养;不定芽;生长调节剂;正交实验法

中图分类号 S663.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2022）05-0059-04

Abstract： With a Rubus resaefolius in the process of subculture， the best explants were selected for sterilization treatment， 6-BA， IBA and NAA for induction of adventitious buds of Rubus resaefolius. Based on the single factor experiment of three regulators， orthogonal experiment was designed to select the best combination of subculture culture growth regulators. The results showed that the survival rate of explants treated with 75% alcohol for 30s and 0.1% HgCl2 for 7 minutes， while the highest proliferation coefficient was 8.07 when the concentration of 6-BA was 0.6mg·L-1， and the highest growth coefficient was 7.03 when the concentration of IBA was 0.02mg·L-1， and the highest increase coefficient was 6.87 when the concentration of NAA was 0.02mg·L-1; When the three growth regulators were used together， the highest proliferation coefficient was obtained when the concentration of 6-BA was 0.6 mg · L-1， IBA was 0.06 mg·L-1 and NAA was 0.02mg·L-1.

Key words： Rubus resaefolius; Tissue culture; Adventitious bud; Growth regulator; Orthogonal experiment

懸钩子属植物成熟果实多浆，味酸甜，在欧美有长期栽培食用的历史[1-2]。近年来，悬钩子属的红树莓（Rubus idaeus L.）、黑树莓（Rubus mesogaeus）作为优质水果被大量引入中国，产生了较高的社会经济价值[3-4]。与国外对比，我国丰富的野生悬钩子资源尚未得到充分的开发利用[1]。空心泡（Rubus resaefolius）果实外形饱满，风味极佳，除鲜食外，也可加工成果汁、果酒、蜜饯等，是一种优良的野生果树资源。但由于其自然状态下产量较低、分布较散，近年来有种植者尝试规模化开发利用，但优质种苗和配套技术存在问题[5]。为此，本试验通过建立空心泡组培快繁体系，优化生长调节剂的使用，增加繁殖系数，以达到快速育苗和降低育苗成本的目的，旨在为野生悬钩子植物空心泡的快速高效繁育和实现工厂育苗提供可靠的技术依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料 外植体选用贵州省植物园悬钩子育苗圃内无病虫害空心泡长势一致的枝条。去除叶片、叶柄留下中部茎段，以洗涤剂浸泡20min，在流水下刷去泥沙附着物，并冲洗10min，将清洗后的枝条剪成带腋芽1～2cm的长茎段。

1.2 试验方法[6-11] 培养环境：培养室温度（25±2）℃、湿度（60±5）%，光周期14h·d-1，调节电流、光源与植株距离，使光强保持一致（1500lx）。培养基：采用MS培养基，蔗糖浓度30%，琼脂7.5%，pH值为5.8。生长调节剂：初代培养不添加植物生长调节剂;采用预实验中效果较佳的6-BA（苄氨基腺嘌呤）、IBA（吲哚丁酸）、NAA（萘乙酸）。

1.2.1 外植体的灭菌处理 外植体灭菌剂的选择、灭菌时间的把控对外植体的污染率、成活率具有直接影响。试验选择75%酒精（10s、20s、30s）和0.1%升汞（4min、7min、10min）组合处理，灭菌处理完毕的外植体接入培养瓶内，每瓶1株，每处理10瓶，重复3次，21d后调查接种污染率、存活率。计算公式如下：

污染率=（污染的外植体数/接种的外植体数）×100;

成活率=（萌动的外植体数/接种的外植体数）×100

1.2.2 生长调节剂单因素试验 为探究不同浓度生长调节剂对不定芽增殖的影响，以MS为培养基，将6-BA、IBA、NAA设置5种浓度：6-BA（0.2mg·L-1、0.4mg·L-1、0.6mg·L-1、0.8mg·L-1、1.0mg·L-1）、IBA（0.02mg·L-1、0.04mg·L-1、0.06mg·L-1、0.08mg·L-1、0.10mg·L-1）、NAA（0.02mg·L-1、0.04mg·L-1、0.06mg·L-1、0.08mg·L-1、0.10mg·L-1）。每个处理10头不定芽，3次重复，30d后统计增殖系数。计算公式如下：

增殖系数=不定芽总数/接种的不定芽数

1.2.3 增殖培养正交试验 以初代培养的不定芽为试验材料，进行继代培养，设计3因素3水平L9（33）正交表进行试验设计，在悬钩子属植物最常用的激素中挑选6-BA、IBA、NAA设计3因素3水平的正交试验，观察记录生长系数，每个处理10个不定芽，3次重复，30d后计算增殖系数。因素水平：6-BA（0.2mg·L-1、0.4mg·L-1、1.0mg·L-1），IBA（0.02mg·L-1、0.04mg·L-1、0.1mg·L-1），NAA（0.02mg·L-1、0.04mg·L-1、0.1mg·L-1）。

1.3 数据处理 数据采用Excel表格统计，SPSS26.0进行分析比较。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂对外植体的影响 由表1可知，灭菌剂的灭菌时间对外植体的污染率和成活率有着显著影响。随着灭菌时间的增加，外植体的污染率不断降低。在酒精消毒时间不变的条件下，10s和20s酒精灭菌时间的影响下，随着升汞灭菌时间的延长，污染率水平呈现出差异显著性，仅在30s酒精消毒条件下外植体污染率无差异显著性。说明利用0.1%升汞灭菌时，时间对灭菌效果有一定的影响力，在升汞消毒时间不变的条件下，通过改变酒精的灭菌时间也可以得到类似结果。说明单一灭菌剂难以获得理想的灭菌效果，联合施用的灭菌效果更为理想。随着灭菌时间的延长，外植体成活率呈现出快速增加，但在高灭菌时间处理中，会出现部分死亡的植株，这是因为过长的灭菌处理损伤了外植体生长点产生毒害，导致外植体死亡。本次试验材料最佳的灭菌处理是30s酒精和7min升汞处理，能达到较低的污染率和最高的成活率。

2.2 不同生长调节剂对不定芽的影响

2.2.1 6-BA浓度 6-BA是最常用的细胞分裂素，可促进细胞和芽的生长、芽的分化。由图1可知，增殖系数随着6-BA浓度的升高呈现出先增加后减少的趋势，且与0.2mg·L-1时差异显著。在浓度为0.6mg·L-1时，增殖系数最大为8.07。

2.2.2 IBA浓度 IBA能促进细胞分裂与细胞生长。由图2可知，在浓度为0.02mg·L-1时增殖系数最大，在浓度为0.04mg·L-1、0.06mg·L-1、0.08mg·L-1时增殖系数差异不显著，但浓度为0.1mg·L-1时与增殖系数最低，且与其他浓度差异显著。增殖系数随着IBA浓度的升高呈现出减少的趋势，表明低浓度时IBA能促进外植体不定芽的增殖，高浓度表现为抑制。

2.2.3 NAA浓度 NAA能促进细胞分裂与细胞生长以及芽的分化。由图3可知，NAA浓度为0.02mg·L-1时增殖系数最大为6.87，NAA浓度为0.04mg·L-1、NAA浓度为0.06mg·L-1、NAA浓度为0.08mg·L-1时增殖系数分别为5.97、5.8、5.23，且差异不显著;NAA浓度为0.1mg·L-1时增殖系数最低为4.63，且与其他试验浓度存在差异显著。增殖系数随着NAA浓度的升高呈现出先增加后减伤的趋势，这表明低浓度的NAA能促进外植体不定芽的增殖，而高浓度表现为抑制。

2.3 筛选最佳生长调节剂配方 由表2可知，培养基处理6（6-BA浓度0.6mg·L-1、IBA0.02mg·L-1、NAA0.02mg·L-1）平均增殖系数为9.70，植株长势健壮，生长较快，叶片翠绿，为本试验下最佳生长调节处理组合。在3个水平的生长调节剂处理下，K2值最大，K3值其次，K1值最小，表明在不同水平的处理下，中水平处理下的因素对外植体增值系的数影响更大;通过对极差R值大小的比较，本试验采用的3种植物生长调节剂对外植体增殖系数的影响如下：6-BA（11.76mg·L-1）>NAA（4.55mg·L-1）>IBA（4.36mg·L-1），且6-BA的R值远大于NAA和IBA的R值。表明在3种激素的联合使用中，6-BA浓度的影响远大于其他2种生长调节剂，NAA浓度的影响大于IBA浓度的影响;通过对比K1值、K2值、K3值，发现K1值与K2值、K3值呈现一定的相关，表明3种生长调节剂对空心泡的不定芽增殖存在一定的联合作用。

3 结论与讨论

植物生长调节剂是植物组织培养的关键因子之一[9]，通常不同的植物生长调节剂对不同植物外植体具有不同的诱导效果。本试验选用前期预试验中不定芽高于对照组的6-BA、IBA、NAA3种植物生长调节剂进行处理，结果表明，6-BA对空心泡继代培养不定芽的增殖作用较为显著，当三者联用，在6-BA浓度0.6mg·L-1、IBA0.02mg·L-1、NAA0.02mg·L-1时，有着最大的不定芽增殖系数，为空心泡最佳的继代培养生长调节剂配方。

对外植体进行灭菌处理是建立组织培养体系的重要环节。针对空心泡，本实验筛选出75%酒精灭菌30s结合0.1%升汞处理7min的方法最佳。结合文光琴等[9]的研究结果，初代培养基不添加任何植物生长调节剂的MS培养基，可避免生长调节剂的积累叠加。在后续培养中，可以通过调节光照强度、降低环境温度等方法降低组培苗的玻璃化现象。外植体接种之后7d，可用暗培养/弱光培养可改善外植体褐化的问题。

参考文献

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