外源褪黑素不同浸种浓度和时长对干旱胁迫下无芒雀麦种子萌发的影响

肖珍珍， 隋晓青*， 石国庆， 陈爱萍， 乌 兰， 张 博*

(1. 新疆农业大学草业学院， 西部干旱荒漠区草地资源与生态教育部重点实验室， 新疆草地资源与生态重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052； 2. 乌苏市林草局， 新疆 乌苏 833000)

随着全球气温升高，干旱和半干旱区水分缺乏和干旱危害日趋加剧，植物的生长发育被严重影响[1]。种子发芽以及幼苗生长是植物整个生命活动的起点，也是其适应外部环境的端点，更是植物生长的敏感时期[2]，这一时期干旱胁迫会直接影响到自然种群定殖和人工种群的田间出苗率[3-5]，从而关系到种群能否建植成功。近年来，植物激素浸种处理已逐步应用于农业生产中，通过激活种胚的新陈代谢促进胁迫条件下种子的出苗率和出苗齐性，在棉花(Gossypiumhirsutum)、大豆(Glycinemax)、小麦(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)等农作物种子研究中得到了很好的验证[6-9]；在草种方面也开展了部分研究，如经褪黑素(melatonin，MT)浸种的黑麦草(Loliumperenne)种子在干旱环境中可不同程度地提高其发芽率[10]，在紫花苜蓿上(Medicagosativa)外源喷施适宜浓度的MT，可以提高紫花苜蓿在干旱胁迫条件下的抗氧化酶活性，抑制氧化伤害从而提高其抗旱性,也可增强氮代谢相关酶的活性，促进氮代谢过程[11]。这些研究结果显示出MT在增强植物抗旱能力方面的独特作用，也进一步表明在逆境下采用激素处理，对促进旱区植物种子萌发及幼苗建成具有潜在应用前景[12]。

MT(N-乙酰-5-甲氧基色胺)是普遍存在于动植物体内的一种低分子量(232.27)吲哚胺类化合物，当前其在植物中的应用已成为植物抗逆性研究的一个相关课题[13]。最近，MT在干旱胁迫、钒胁迫、盐胁迫等条件下对植物的缓解作用得到证实[14-20]。研究表明MT在种子萌发中起重要作用[21]，但不同的种质采取MT处理的浓度和时间不尽相同，如在棉花种子中低浓度MT(20 μmol·L-1)能够促进萌发，而高浓度则降低了种子的萌发率[22]。在荞麦(Fagopyrumesculentum)种子中200 μmol·L-1MT浸种12 h能够显著提高150 mmol·L-1盐胁迫下种子的发芽率和发芽势[23]。大豆种子的芽长、发芽率、发芽指数及生物量在盐碱胁迫下通过100 μmol·L-1MT浸种处理8 h被显著提高[24]。李本峰等[10]研究发现不同浓度MT浸种12 h会显著提高PEG胁迫下多年生黑麦草种子的发芽势和发芽率。而在中旱生无芒雀麦(Bromusinermis)种子萌发中MT是否对干旱胁迫存在缓解效应？如果存在，那么适宜的处理浓度和时长是多少？目前还未见相关报道。

无芒雀麦是禾本科雀麦属的一个种，属于多年生冷季型长寿牧草，是重要的护坡和水土保持植物[25]，在我国北方干旱半干旱地区具有重要的栽培应用价值，是天然草地补播和人工草场建植的重要草种[26]。目前，关于不同浓度外源MT浸种对无芒雀麦种子萌发的抗旱效应尚缺乏相关评价，基于此，本研究以乌苏1号无芒雀麦(Bromusinermiscv. Wusu No.1)为研究对象，探究干旱胁迫下MT浸种处理后的种子萌发效应，筛选促进无芒雀麦种子萌发的最佳浸种浓度及时长，为干旱半干旱区无芒雀麦建植生产提供可行操作方法，同时为外源MT缓解无芒雀麦及其他禾本科草种干旱胁迫的生理机制研究提供理论依据与借鉴。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选用乌苏1号无芒雀麦为试验材料，该材料来源于新疆乌苏市草原站林草局，经检测发芽率为89.20%。褪黑素(MT)购自北京索莱宝科技有限公司，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG-6000)购自天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

选择成熟、饱满的无芒雀麦种子为萌发材料，种子用75%酒精浸泡消毒30 s，蒸馏水冲洗3次，每次2 min，自然晾干。将种子分组避光浸没于0 μmol·L-1，25 μmol·L-1，50 μmol·L-1，75 μmol·L-1，100 μmol·L-1和200 μmol·L-1MT溶液中，浸种时长分别为12 h，24 h，48 h。用PEG模拟干旱胁迫，根据前期的预试验结果，设定PEG浓度为23%。种子处理包括：PEG+0 μmol·L-1MT处理、PEG+25 μmol·L-1MT处理、PEG+50 μmol·L-1MT处理、PEG+75 μmol·L-1MT处理、PEG+100 μmol·L-1MT处理、PEG+200 μmol·L-1MT处理，以施加蒸馏水为CK组。将浸种处理后的种子分别均匀播入培养皿内(φ9 cm)，培养皿内铺两层滤纸，每皿播100粒，分别加入6 mL处理液，每个处理重复4次。将所有培养皿置于培养箱中发芽(光周期16 h/8 h，昼温25℃，夜温15℃)。每天记录种子的萌发数。种子发芽过程中，每日用天平称量培养皿重量，补充去离子水使培养皿达到原重量，从而使PEG溶液浓度保持不变。

1.3 测定指标及方法

种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数参考孙可萌等[27]的计算方法。4次重复中有1粒种子萌发，即为发芽起始，之后每24 h统计1次发芽种子数，以胚根突破种皮2 mm作为发芽标准。在发芽7 d后计算发芽势，14 d后计算发芽率、发芽指数和活力指数。

发芽指数= Σ(Gt/Dt)，式中：Gt表示在t时间内的发芽数目，Dt为相应的发芽天数。

活力指数=SH×Σ(Gt/Dt)，式中：SH为发芽结束时种子的平均胚芽长。

1.4 无芒雀麦萌发期抗旱性综合评价

参考Fang等[28]和段利萍等[29]的方法，用模糊数学中隶属函数法建立综合评价体系，分析种子在萌发期应对干旱胁迫的能力。不同浓度外源MT浸种处理种子后，通过建立综合评价体系，用某一指标的均值反映无芒雀麦种子萌发的抗旱效应，系统地评价MT浸种处理后无芒雀麦种子在萌发期的抗旱能力。评价体系中有关隶属函数及权重等的计算方法如下：

(1)

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(4)

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1.5 数据分析

数据使用Excel 2010录入，采用SPSS 19.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 褪黑素浸种对干旱胁迫下无芒雀麦种子萌发的影响

如表1所示，浸种12 h处理下，蒸馏水(0 μmol·L-1MT)浸种的无芒雀麦种子在干旱胁迫下发芽率为70.67%，较CK显著降低(P<0.05)，而不同浓度MT处理后无芒雀麦种子的平均发芽率均较0 μmol·L-1MT浸种有所提高。0 μmol·L-1MT浸种的无芒雀麦种子在干旱胁迫下发芽势比CK降低了55.39%(P<0.05)；25,75,100,200 μmol·L-1处理后发芽势均较0 μmol·L-1MT浸种提高了15.83%，10.83%，38.33%和6.67%(P>0.05),50 μmol·L-1MT处理后发芽势较0 μmol·L-1MT浸种提高了40%(P<0.05)。0 μmol·L-1MT浸种的无芒雀麦种子在干旱胁迫下发芽指数较CK显著降低(P<0.05)，而不同浓度MT处理后无芒雀麦种子的发芽指数较0 μmol·L-1MT浸种均有所提高(P>0.05)。0 μmol·L-1MT浸种的无芒雀麦种子在干旱胁迫下活力指数比对照降低了72.46% (P<0.05)，MT浓度由低到高处理后种子活力指数分别较0 μmol·L-1MT浸种提高了35.71%，64.22%，29.10%，38.66%和40.19%。0 μmol·L-1MT浸种的无芒雀麦种子在干旱胁迫下胚芽长较CK显著降低(P<0.05)，当添加外源MT后胚芽长较0 μmol·L-1MT浸种处理有所升高，但不同浓度MT处理组之间的胚芽长差异不显著(P>0.05)。

表1 褪黑素浸种对无芒雀麦种子萌发指标的影响Table 1 Effect of melatonin immersion on seed germination indexes of Bromus inermis

浸种24 h处理下，0 μmol·L-1MT浸种的无芒雀麦种子在干旱胁迫下发芽率为61.33%，较CK(95.67%)显著降低(P<0.05)，而50 μmol·L-1，75 μmol·L-1，100 μmol·L-1，200 μmol·L-1MT处理后无芒雀麦种子的发芽率较0 μmol·L-1MT浸种显著提高(P<0.05)。0 μmol·L-1MT浸种的无芒雀麦种子在干旱胁迫下发芽势比CK降低了59.32%(P<0.05)，除低浓度MT处理外，其他浓度MT处理后种子的发芽势较0 μmol·L-1MT浸种处理显著提高(P<0.05)。0 μmol·L-1MT浸种的无芒雀麦种子在干旱胁迫下发芽指数、活力指数较CK显著降低(P<0.05)，而不同浓度MT处理后无芒雀麦种子的发芽指数及活力指数除低浓度处理外其他处理均较0 μmol·L-1MT浸种处理显著提高(P<0.05)。0 μmol·L-1MT浸种的无芒雀麦种子在干旱胁迫下胚芽长较CK显著降低(P<0.05)，外源MT处理后胚芽长较0 μmol·L-1MT浸种处理均有所增高，但不同浓度MT处理组之间的胚芽长差异不显著(P>0.05)。

浸种48 h处理下，0 μmol·L-1MT浸种的无芒雀麦种子在干旱胁迫下发芽率为72.33%，较CK(92.50%)显著降低(P<0.05)，而25 μmol·L-1，50 μmol·L-1，75 μmol·L-1，100 μmol·L-1MT处理后无芒雀麦种子的发芽率均较0 μmol·L-1MT浸种提高了18.90%，26.27%，22.59%，25.35%(P<0.05)。0 μmol·L-1MT浸种的无芒雀麦种子在干旱胁迫下发芽势比CK降低了50.43%(P<0.05)；不同浓度MT处理组之间的发芽势差异不显著(P>0.05)。0 μmol·L-1MT浸种的无芒雀麦种子在干旱胁迫下发芽指数、活力指数及胚芽长较CK显著降低(P<0.05)，而不同浓度MT处理组之间的发芽指数、活力指数及胚芽长差异不显著(P>0.05)。

浸种时长和浸种浓度互作对各处理间胚芽长无显著影响，但对发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数具有显著影响，发芽率以0 μmol·L-1，25 μmol·L-1MT浸种48 h较好，显著高于24 h处理(P<0.05)；发芽势以100 μmol·L-1，200 μmol·L-1MT浸种24 h较好，显著高于其他浸种时长处理(P<0.05)；发芽指数以50,100,200 μmol·L-1MT浸种24 h较好，显著高于其他浸种时长处理(P<0.05)；活力指数以CK，50 μmol·L-1，100 μmol·L-1，200 μmol·L-1MT浸种24 h较好，显著高于其他浸种时长处理(P<0.05)。

2.2 MT浸种处理下无芒雀麦种子萌发期抗旱效应

使用单一指标分析无芒雀麦的抗旱性具有片面性，采用隶属函数计算可以克服少数指标评价的不足，因其得到的值为0～1区间内的纯数而使各项指标具有可比性，再结合权重对每个处理各指标的隶属函数值求和，从而可对各处理进行综合性评价。在表2中，D值代表外源MT浸种时长及浸种浓度配比下无芒雀麦种子萌发的抗旱效应，隶属函数综合分析结果显示，PEG+MT75+T24处理的综合得分值最高，即MT浓度为75 μmol·L-1浸种24 h时效果最好。各处理综合得分大小顺序如下：PEG+MT75+T24>PEG+MT0+T12>PEG+MT200+T24>PEG+MT100+T24>PEG+MT50+T24>PEG+MT75+T12>PEG+MT25+T12>PEG+MT50+T48>PEG+MT25+T24>PEG+MT0+T24>PEG+MT25+T48>PEG+MT200+T48>PEG+MT100+T48>PEG+MT50+T12>PEG+MT200+T12>PEG+MT75+T48>PEG+MT100+T12>PEG+MT0+T48。

表2 无芒雀麦不同萌发指标隶属函数分析Table 2 Membership function analysis of different germination indexes of Bromus inermis

3 讨论

干旱作为一个重要的环境逆境因子已经成为世界性灾害之一，不仅直接影响到植物种子萌发，而且会造成植物产量和品质的下降[30]。MT是一种多功能的效性分子，不仅具有生长素的部分生物学活性，而且能够调控逆境中植物种子的萌发[31-32]。研究表明，利用MT浸泡燕麦种子，发现100 μmol·L-1MT处理促进种子萌发，进而使幼苗的株高、茎粗及生物积累量有了大幅度提升[14]。梁佳等[12]研究发现，经MT(0.25和0.5 mmol·L-1)引发可有效促进干旱胁迫下种子萌发，MT浓度为0.5 mmol·L-1时效果最佳。本研究进一步证实了MT对非生物胁迫的效应，干旱胁迫下无芒雀麦种子的发芽率随MT浓度的增加呈先升高后下降的趋势，MT浓度为50 μmol·L-1时，种子萌发率达最大值。本试验结果表明，MT对无芒雀麦种子萌发的影响与所施用的剂量密切相关，适宜浓度MT(50 μmol·L-1MT)可缓解干旱胁迫对无芒雀麦种子萌发产生的抑制作用。

发芽指数和活力指数是反映种子活力的重要指标，水和氧气是种子发芽的决定性因素，种子吸水多少与浸种时间长短有密切关系，但并不代表浸种时间越长越有利于种子发芽，在最适的MT浸种浓度下，浸种时长对种子活力影响不一样。发芽指数及活力指数最高的浸种时长是24 h，延长和缩短浸种时长会使种子发芽指数及活力指数下降。由此可见，无芒雀麦种子活力高低与MT浸种浓度和浸种时长密切相关，必须优化浸种浓度和时长才能达到最佳的种子发芽效果。

本研究发现，在同一浓度条件下，不同浸种时长处理对种子萌发的影响存在差异。无芒雀麦种子在高浓度下随浸种时长的增加，所有指标表现出先增加后降低的趋势，说明MT对种子萌发存在一定的浓度效应。此外，在同一浸种时长下，不同浓度MT处理后，种子萌发的单项指标也存在较大差异，这与干旱胁迫条件下MT浸种处理玉米(Zeamays)种子的研究结果相似，均表现出MT对种子萌发的时间效应[33]。综合来看，MT浸种浓度、浸种时长及两者间的交互作用对无芒雀麦种子萌发均有不同的效应，至于这些因素是如何作用于种子内部而引起其生理生化的变化，还有待进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，各浓度外源MT浸种不同时长均可有效缓解干旱胁迫对无芒雀麦种子萌发的抑制作用，适宜的MT浸种浓度及浸种时长可提高无芒雀麦种子在萌发期的抗旱效应。利用隶属函数建立的综合评价体系表明，无芒雀麦种子采用75 μmol·L-1MT浸种24 h后的萌发期抗旱效果最佳，有助于提高无芒雀麦在萌发期的抗旱能力及幼苗群体形态建成，研究结果为外源MT应用于干旱半干旱区草地建植和生态修复的草种引发提供了参考依据。