有机肥对垂穗披碱草根际微生物及土壤理化性质的影响

马 坤， 芦光新*， 邓 晔， 颜珲璘， 王英成， 赵阳安， 张海娟， 周学丽， 窦声云

(1.青海大学农牧学院， 青海 西宁 810016； 2.中国科学院生态环境研究中心， 北京 100080；3.青海省草原改良试验站， 青海 共和 813000)

作为地球的“第三极”，青藏高原具有高海拔、低气温、半干旱等特点，特殊的环境和气候条件导致该地区以高寒草原和高寒草甸生态系统为主[1]。近年来，由于气候变化和人为干预导致该区域草地生态系统严重退化[2]，主要表现为草地土壤退化和植被退化[3-4]。因此，提高牧草产量，缓解牧草资源压力应成为相关研究者主要关心的问题。

其中，施肥是迅速提高草地生产力和改善群落组成，调节牧草营养物质含量的措施之一，但是化学肥料的大规模施用，造成了一系列的环境问题[5]。有研究指出，有机肥的施用有利于促进土壤有机质含量增加、细菌生长及其调节土壤微生物群落的组成和多样性，对进一步增加土壤养分的有效性、提高土壤肥力和提高土壤生产力具有重要意义[6-7]。

土壤微生物在土壤养分循环过程的主导作用影响植物多样性和土壤结构的稳定[8-9]。根际微生物作为土壤微生物重要的组成部分之一，在陆地生态系统中扮演着重要功能，是陆地生态系统土壤质量、生产力和可持续性的敏感指标，对植物养分吸收、抵御逆境等方面具有重要作用[10]。近年来，分子生物学研究方法的进步使得我们能够在更加精细的分子水平上确定土壤微生物群落多样性和组成的变化，越来越多的国内外学者对青藏高原地区氮磷肥的添加对土壤生态产生的影响做了大量研究，Shi等[11]人通过对燕麦(AvenasativaL.)根际微生物多样性的研究表明，与非根际微生物多样性相比，根际微生物α多样性较低。仁增旺姆等发现氮添加对垂穗披碱草地上生物量变化无显著影响，而磷添加不仅提高披碱草人工草地的地上生物量而且可以防止土壤有机碳的损失[12]。然而有机肥对青藏高原地区植物微生物群落结构影响的研究报告相对较少，因此，本试验采用高通量测序技术来检测施用有机肥对高寒地区牧草土壤根际微生物群落多样性和组成的变化，以期阐释施用不同浓度梯度有机肥对牧草土壤理化和土壤根际微生物多样性的影响，为今后青藏高原地区人工增施有机肥提供理论依据，也为‘阿坝’垂穗披碱草在高寒地区的推广提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

禾本科牧草：来自四川省川草生态科技有限责任公司提供的‘阿坝’垂穗披碱草(Elymusnutans‘Aba’);有机肥(有机质含量≥45%，N+P2O5+K2O≥5%，pH值 5.5～8.5)：由四川农业大学资源学院提供技术配方，主要以富含有机质的农作物秸秆和家禽粪便为原料，添加生物发酵剂加工而成。

1.2 试验地点

青海省铁卜加草原改良试验站位于青海湖西岸，位于东经99°35′，北纬37°05′，海拔3 270 m。该地区属高山高原气候，具有光照充足、日照强烈、冬寒夏凉、降雨集中、干旱少雨、风大等气候特征，在青藏高原具有高寒草地生态环境的典型性、代表性。年平均气温-0.7℃，最热月(7月)平均气温17.5℃，最冷月(1月)平均气温-22.6℃，极端温度-34.3℃。无霜期平均为78.7 d，无绝对无霜期。日照时数2 670 h，≥0℃年积温1 331.3℃，年降水量368.11 mm，年蒸发量1 495.3 mm，相对湿度58%。

1.3 试验设计

试验于2020年5月份进行，试验共设3个处理，3次重复，每个小区面积15 m2(3 m×5 m)，CK为不施有机肥，50%梯度即每个小区施有机肥量为5.25 kg，75%梯度即每个小区施有机肥量为7.88 kg，具体处理如表1所示。

表1 试验处理信息Table 1 Test processing information

1.4 测定方法及指标

1.4.1样品采集 采样时间为2020年9月12日至13日，进行土壤样品的采集，在每个样地随机选取3个采样点用土钻钻取表层土壤(0～15 cm)，去除可见植物残体及土壤动物后封装于样品袋中带回试验室，一部分保存于4℃冰箱用于理化性质测定，另一部分保存于-80℃冰箱，用于DNA提取。

1.4.2土壤理化性质测定 用于土壤理化性质测定的样品风干、粉碎后，过0.25 mm孔径网筛进行土壤养分测定。土壤pH值使用pH计(pHS-3C)测定，土壤有机碳(Soil organic carbon,SOC)用重铬酸钾硫酸外加热法；土壤全氮(Total nitrogen,TN)用半微量凯氏定氮法。

1.4.3土壤微生物群落多样性和组成测定测定 从-80℃的冰箱中取出装有样品的无菌管，在超净工作台中取无菌管中的土壤10 g，去除植物残留物和石砾后装于5 mL的无菌管中，放于附有冰袋的泡沫箱中寄到中国科学院生态环境研究中心，采用16S/ITS扩增子测序分析技术测定土壤微生物的多样性及群落结构。为了研究土壤微生物群落的β-多样性差异，采用PCA法对不同施肥梯度下的土壤微生物群落的差异进行研究分析，且基于Bray-curtis距离矩阵的NMDS方法对不同浓度梯度有机肥的土壤微生物群落β-多样性的差异分析。

1.5 数据处理

采用Excle 2010整理数据，运用SPSS 26.0进行实验数据的统计分析。采用SigmaPlot 12.5和Origin 2018作图，图中数据均以平均值±标准差表示。所有测序的原始数据均于中科院生态环境研究中心邓晔研究员课题组的Galaxy分析平台(http://mem.rcees.ac.cn:8080)完成。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

通过对‘阿坝’垂穗披碱草增施不同梯度有机肥的试验，结果表明，与CK相比，施肥梯度为50%时显著增加土壤总氮含量(P<0.05)，明显降低土壤pH值(P<0.05)；施肥梯度为75%时，和对照相比，土壤有机质含量显著增加0.77%(P<0.05)，土壤pH显著降低(P<0.05)。而不同施肥梯度对氨态氮、硝态氮影响不显著。这一结果说明短期施加有机肥仅对土壤总氮、土壤pH值和土壤有机质含量有显著的影响(表2)。

表2 土壤的基本化学性质Table 2 Basic chemical properties of soils

2.2 土壤微生物多样性分析

在铁卜加试验地‘阿坝’垂穗披碱草的9个样本中，检测到土壤细菌2 152 310条序列(图1a)，真菌检测到2 032 477条序列(图1b)，在97%的相似性水平下，所有12个样本得到10 648种细菌分类操作单元(Operational taxonomic unit,OTU)，1945种真菌OTU。对土壤微生物α多样性进行分析，结果表明，与不施肥相比，增施有机肥之后土壤细菌辛普森指数(Simpson evenness)显著增加(P<0.05)，而细菌丰富度指数出现下降趋势(图2a，2b)。土壤真菌辛普森指数(Simpson evenness)呈现出先下降后上升的趋势，在有机肥梯度为75%时辛普森指数最大。真菌丰富度指数因有机肥的添加呈下降趋势。

图1 土壤样品微生物OTU稀释性曲线Fig.1 Soil samples OTU dilution curve of microorganism注：不同颜色代表不同的样品Note：Different colors represent different samples

图2 土壤微生物α多样性Fig.2 Diversity of soil microorganism α.

2.3 土壤微生物群落组成成分

细菌群落中变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)为主要优势菌门，相对丰度超过1%。与不施肥相比，在不同施肥处理下土壤中相对丰度最高的细菌菌门存在差异，其中施有机肥为50%时放线菌门(Actinobacteria)相对丰度最高。在土壤真菌门群落中子囊菌门(Ascomycota)为主要优势菌门，平均相对丰度超过90%。增施有机肥后子囊菌门(Ascomycota)的相对丰度低于CK(87%vs 96%)，施肥量为50%时担子菌门(Basidiomycota)平均相对丰度最高为3.25%(CK1.49%)。

对土壤细菌和真菌进一步在属水平进行群落组成成分比较(图3c,3d)，土壤细菌属的研究结果表明，节杆菌(Arthrobacter)、微小杆菌(Exiguobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌(Rhizobium)增施有机肥前后相对丰度无明显变化，不动杆菌(Acinetobacter)平均相对丰度增施有机肥后明显降低，施有机肥量50%时，其平均相对丰度为0%。对土壤真菌属水平的分析表明，土壤真菌不同属在不同处理下的分布存在较大的差异(图4 d)，不同处理下的优势属也各不相同。赤霉菌属(Gibberella)、亚隔孢壳属(Didymella)、裂殖壶菌(Schizothecium)属为主要优势属，相对丰度在 8.0%～16.5%之间；Kotlabase，Preussia，Fusarium属为次要优势属，相对丰度在 3.02%～6.5%之间。与CK相比，增施有机肥后Didymella,Schizothecium(裂殖壶菌)、Katabases属的相对丰度下降，而赤霉菌属(Gibberella)、内生真菌(Preussia)、镰刀菌(Fusarium)属在施肥量为75%时其相对丰度最高，分别为17.6%，7.5%，4.4%。

图3 土壤微生物群落组成Fig.3 Composition of soil microbial community

图4 土壤微生物群落主成分分析Fig.4 Principal component analysis of soil microbial community

2.4 土壤微生物群落结构

对于土壤细菌来说PCA分析中主成分轴PCA1可以解释 73.8%的差异，PCA2轴可以解释 15.8%的群落差异。对于土壤真菌则是第一主成分轴PCA1解释了40.1%的群落差异，第二主成分轴PCA2解释了23.6%的群落变化。这一结果表明，细菌群落和真菌群落在不同浓度有机肥处理下的微生物群落均存在差异，其中有机肥对细菌微生物群落结构的影响比真菌更为明显。

基于非度量多维尺度(Non-metric multidimensional scaling,NMDS)结果如图5所示，NMDS指数结果显示对照和各处理间细菌群落结构明显不同，显著性检验分析进一步表明细菌群落和真菌群落在对照和各处理之间存在显著的差异(表3)。施肥明显改变了细菌群落结构，真菌群落结构受有机肥影响较小。

表3 有机质添加对土壤微生物群落结构作用的显著性检验Table 3 Significance test of the effect of organic matter addition on soil microbial community structure

图5 基于Bray-curtis距离矩阵的NMDS分析Fig.5 NMDS analysis based on Bray-Curtis distance matrix

3 讨论

3.1 施肥对土壤理化性质的影响

施肥是增加土壤肥力的有力措施，其最直接的作用是通过改变土壤养分含量而间接影响牧草生产力和有机质含量。有研究发现短期施加无机肥可以显著影响退化羊草(Leymuschinensis(Trin.) Tzvel.)草原土壤速效氮、速效钾等速效养分的含量，但对土壤全氮、有机质等指标没有明显的改变[14]。刘杏兰等[15]发现单施有机肥可以显著增加土壤全氮含量。本研究表明，在50%，75%有机肥施加处理下有助于土壤养分和有机质的积累，且有助于缓解土壤盐碱化程度，从而对进一步改善土壤养分缺乏、土壤健康状况和提高牧草产量起促进作用。土壤pH值通过影响土壤溶液中有效离子的浓度来影响植被生长[16]，有机肥可为植被生长提供养分。大量研究证明，长期施加无机肥会导致土壤pH值降低，引起土壤酸化，有机肥替代无机肥可以提高深层土壤的肥效和耐酸性，减缓因单独施加无机肥产生的土壤酸化趋势[15,17]。本试验结果显示，添加有机肥梯度在50%，75%时可有效缓解土壤盐碱化程度，使土壤pH值趋于中性，进而提高土壤健康状况。

3.2 施肥对土壤微生物群落结构与多样性的影响

3.2.1施肥对土壤微生物丰度和多样性的影响 土壤中的细菌和真菌通常占土壤微生物总量的90%以上，它们是土壤有机质的分解者和养分动态的主要调节剂[18]。土壤微生物对于维持土壤肥力和土壤生态系统功能至关重要，且对肥料敏感[19]。本试验检测到细菌OTU数高于真菌，与杨希智等[20]对高寒地区土壤微生物的研究结果相一致。有机肥的添加可以显著改变土壤微生物群落多样性和丰富度，大量研究结果表明，增施有机肥可以增加土壤中细菌和真菌的多样性和丰富度[21]。长期施用有机肥会降低土壤真菌多样性组成，使其向担子菌门等方向演替进化[22]。这说明随着不同梯度有机肥的添加，土壤中细菌与真菌的群落多样性指数和丰富度指数有着不同的变化趋势，其中细菌的群落多样性指数在施有机肥梯度为50%时最大，真菌的群落多样性在75%梯度下最大。有机肥的添加降低了细菌的丰富度指数，可能原因是高寒地区微生物对短期施加有机肥的响应是一个错综复杂的动态响应过程。

3.2.2施肥对土壤微生物群落结构的影响 ‘阿坝’垂穗披碱草根际微生物群落结构在门和属水平上研究结果表明，在门水平，细菌群落中变形菌门、放线菌门和厚壁菌门为主要的优势菌门，与学者对草地微生物相关研究结果一致[22-23]。施肥梯度为50%时，明显增加了放线菌门的数量。放线菌门作为细菌中占比较大的一类，在相关有机物的分解等重要过程中起着关键作用，有研究证明，放线菌可以合成多种与抗病原菌有关的抗生素，保护土壤与根系免受病原菌的侵害[24]。试验结果显示，放线菌门对有机肥的敏感性较强，大量的有机肥可能导致放线菌门数量的减少，而变形菌门和厚壁菌门对有机肥的敏感性弱于放线菌门，在不同施肥梯度下没有显著差异。真菌门水平的平均相对丰度明显低于细菌，子囊菌门为主要优势菌。稀有菌群有担子菌门、毛霉菌门等。研究已经证实，担子菌门是真菌中最高等的一门，分布极为广泛，它与植物能形成共生菌根，帮助植物更好的生长[25-26]。增施有机肥后，子囊菌门的相对丰度出现下降，子囊菌门大多为腐生菌，其最适pH值为弱碱性，可能原因是由于施肥导致pH值下降，进而引起子囊菌门减小，可能是由于高寒地区牧草根际土壤微生物与菜田中微生物对外界环境变化所作出的应答机制不一样[27]。而担子菌门平均相对丰度随着有机肥的添加，其数量明显上升，在施有机肥梯度为50%时，数量达到最大。当时有机肥为75%时又出现下降趋势，表明有机肥的添加对担子菌门的影响较大，一定量的有机肥可以明显提高担子菌门的数量，当有机肥大量投入后引起毛霉菌门等一些有害真菌的滋生，不利于土壤保持健康状况。

为更深层次明确有机肥肥对高寒地区土壤微生物群落的影响，本研究进一步对细菌和真菌在属水平进行群落组成成分比较，土壤中细菌和真菌在属水平均具有较高的平均相对丰度。在细菌属水平上，增施有机肥后，不动杆菌属相对丰度显著下降，在施有机肥梯度为50%时，不动杆菌为零。大量试验已经证实不动杆菌为病原菌，可能对植株及人体造成不同程度的伤害[28]，一定量的有机肥可以抑制不动杆菌的发生，改善土壤中微生物生态。对真菌属的丰度分析表明，赤霉菌属、亚隔孢壳属、裂殖壶菌属为主要优势菌，赤霉菌可以分泌赤霉素，促进植物茎的生长；亚隔孢壳属属于子囊菌纲，是一类腐生菌[29]；裂殖壶菌中二十二碳六烯酸含量高，是一类极具工业化前景的微生物资源[30]。增施有机肥后，主要优势菌发生明显变化，当施肥梯度达到75%时，赤霉菌属含量明显上升。亚隔孢壳属和裂殖壶菌数随着不同梯度有机肥的添加，呈现出下降趋势。Kotlabase，preussia(内生真菌属)和Fusarium(镰刀菌属)为次要优势菌，其中内生真菌作为一类重要的微生物资源可以在植物体内生存又不会伤害植物，大量研究发现内生真菌可以显著提高植物抵御盐胁迫的能力[31]。本试验得出不同梯度的有机肥处理可以显著影响内生真菌属相对丰度的变化，当施肥梯度为75%时，内生真菌属平均相对丰度达到最大，这可能是由于有机肥的添加可以为内生真菌的繁衍提供适宜的生存环境，从而促进了内生真菌的繁衍。

有机肥剂量不同的土壤中，微生物群落结构也相应出现区别[32]，β多样性结果显示细菌群落结构对不同剂量有机肥的响应比真菌更为敏感，武发思等[33]研究发现有机肥对根际土壤细菌群落结构的改变作用明显，本试验结果同时发现细菌群落组成受有机肥剂量的影响较大，其具体的演变进化趋势是后续试验研究的重点。

4 结论

高寒地区增施有机肥对‘阿坝’垂穗披碱草土壤理化性质和土壤微生物养分有明显的改善。使用50%有机肥，不仅提高了土壤全氮的含量，降低土壤pH值，还可以显著增加土壤优势菌放线菌、担子菌门的相对丰度，明显抑制了病原菌不动杆菌的相对丰度。添加75%有机肥，可以显著增加土壤有机质含量，降低pH值，明显提高真菌属水平一些促进植物生长发育的相关菌群赤霉菌属、内生真菌属等。此研究结果为青藏高原地区有机肥的推广提供了理论支撑。