纳豆菌NT-6发酵患病畜禽肉骨粉制备微生物肥料

唐晓山，侯小琴，孙力军，*，房志家，邓 旗

(1.岭南师范学院 分析测试中心，广东 湛江 524048；2.广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江 524088)

近年来，病死畜禽的无害化处理工作引起了社会各界的高度重视，各地陆续建立起病死畜禽无害化处理机构。病死畜禽经高温化制后会产生大量的肉骨粉，但由于患病动物在治疗过程中使用了大量的抗生素，这些肉骨粉中的抗生素残留严重超标，限制了其在饲料中的应用，大多只能被直接丢弃，既造成资源的浪费，又污染了环境。目前，患病动物无害化处理后的下脚料(肉骨粉)产量很大，且具有较高的营养价值，因此产业和市场都迫切需要开发高效、安全、低成本的患病动物肉骨粉减害化、高值化加工技术。

有研究表明，抗菌脂肽在植物病虫害防治方面有重要作用。抗菌脂肽除了可以直接抑制病原微生物的生长之外，还可以增强植物的免疫力，增强植物抗性潜力。Touré等将一株可产生抗菌脂肽(伊枯草菌素、丰原素和表面活性素)的枯草芽孢杆菌应用于苹果采后的真菌防治中，发现无论是该菌体还是其发酵液均能有效降低疾病的发生。曹婷婷等发现，枯草芽孢杆菌产生的捷安肽素可以有效防治采后柑橘青绿霉菌病。作者团队前期研究发现，纳豆芽孢杆菌NT-6能有效降解患病动物肉骨粉中的抗生素，并且可以产生大量的能够有效防治植物霉菌病的脂肽类化合物。因此，利用纳豆芽孢杆菌NT-6发酵患病动物肉骨粉，不仅可以降解肉骨粉中的抗生素，还可以生产微生物肥料，对生态环境保护、工农业发展均具有积极意义。

本研究拟利用患病畜禽肉骨粉作为主要发酵基质，以纳豆芽孢杆菌NT-6作为发酵菌和功能菌，制作具有抑制立枯丝核菌(Kühn)功效的新型微生物肥料。首先，利用单因素试验和响应面设计优化发酵条件，确定最佳生产工艺条件；然后，利用盆栽试验探索成品微生物肥料对立枯丝核菌的抗性，以期开辟患病动物肉骨粉综合利用的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纳豆芽孢杆菌NT-6、立枯丝核菌SK215，均来源于广东海洋大学食品科技学院CAMT团队；供试肉骨粉来源于湖北省某病死畜禽无害化处理公司；丰顺番茄，购于湛江市大地蔬菜种子有限公司；麸皮，购于湛江市赤坎华强面粉厂；稻壳，购于湛江市霞山区盛玉米厂；供试土壤，采自广东海洋大学农学院海博楼；营养琼脂，购于北京陆桥技术股份有限公司。

主要仪器包括：SPX-250B-Z型生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Gerhardt牌全自动凯式定氮仪，德国Gerhardt。

1.2 NT-6与SK215的拮抗培养试验

将斜面保藏的NT-6和SK215各挑1环分别进行三区划线，于37 ℃培养24 h，完成菌株活化。挑取活化后的单菌落加到LB肉汤培养基中，37 ℃、150 r·min振荡培养24 h，得测试菌液。

将PDA培养基与营养琼脂培养基以1∶1的比例混合，制作成既适合SK215生长、又适合NT-6生长的混合培养基。先在平皿底部倒制一层薄薄的营养琼脂培养基，待其冷却后，在上面再倒上制好的混合培养基，冷却后，在平皿的中央位置采用点植法接种SK215，于28 ℃培养2 d。之后，在SK215菌落附近(相隔0.5 cm)在上下左右4个位置各用接种环点接NT-6菌种，于28 ℃培养2～4 d，观察平板上SK215菌落的生长状况。

1.3 发酵产物中NT-6菌量的计数

挑取一环斜面上的NT-6于LB肉汤液体培养基中，于37 ℃、150 r·min振荡培养24 h，得到NT-6种子液。

将一定量的肉骨粉、麸皮和稻壳混匀，装入250 mL锥形瓶内，加入一定量的水，制成发酵基质，将发酵基质的pH值调至7.0左右，121 ℃灭菌15～20 min，取出冷却至室温后，按照50 mL·kg的接种比例NT-6种子液，30 ℃发酵，每6 h搅拌一次。

发酵完成后，利用梯度稀释法将发酵产物制成1×10、1×10、1×10的稀释液，采用稀释涂布平板法涂布LB营养琼脂培养基，37 ℃倒置培养24 h，取出后计数。菌量多时，采取四分法计数。每组试验设置3个平行。

1.4 基于单因素试验设计的发酵条件优化

1.4.1 水分含量

将发酵基质中肉骨粉与麸皮的质量分别设定为8 g与2 g，再添加稻壳0.8 g，将发酵基质中的水分含量分别设为总发酵物质量的0、31.6%、48.1%、58.1%、64.9%(即分别加水0、5、10、15、20 mL，下同)，30 ℃发酵24 h，测定NT-6菌量。

1.4.2 肉骨粉与麸皮的配比

将发酵基质中的肉骨粉与麸皮按照10∶0、9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5、8∶2、7.5∶2.5的质量比混合(总质量为10 g)，再添加稻壳0.8 g，加水15 mL，将初始pH值调至7.0，30 ℃发酵24 h，测定NT-6菌量。

1.4.3 稻壳添加量

将发酵基质中肉骨粉与麸皮的质量分别设定为8 g与2 g，再分别添加稻壳0、0.4、0.8、1.2、1.6 g，加水15 mL，将初始pH值调至7.0，30 ℃发酵24 h，测定NT-6菌量。

1.4.4 发酵时间

将发酵基质中肉骨粉与麸皮的质量分别设定为8 g与2 g，再分别添加稻壳0.8 g，加水15 mL，将初始pH值调至7.0，30 ℃分别发酵24、48、72、96、120 h，测定NT-6菌量。

1.5 基于响应面法的发酵条件优化

在单因素试验的基础上，以发酵基质中的水分含量()、肉骨粉与麸皮的配比()、稻壳添加量()、发酵时间()作为考查因素，以菌量为考查指标，采用Design-Expert 8.0.6软件进行4因素3水平的Box-Behnken试验设计，共29组试验，每组试验均设置3个平行。其中，、、、的3个编码水平(-1、0、1)分别对应于50%、60%、70%，9∶1、8∶2、7∶3，0.4、0.8、1.2 g，72、96、120 h。通过响应面试验，优化发酵条件。

1.6 基于蛋白质降解率的发酵终点确定

除发酵时间外，按照1.5节得到的最佳发酵条件重新发酵一批肉骨粉，每2 d检测一次发酵基质中蛋白质的降解率。当蛋白质的降解率基本稳定时，判断为发酵终点，然后于55 ℃恒温鼓风干燥，包装。

蛋白质降解率的测算方法简述如下：采用微量凯氏定氮法测定总氮含量；采用水合茚三酮比色法测定氨基酸态氮含量；用15%(体积分数)TCA(三氯乙酸)沉淀去除蛋白后，再用微量凯氏定氮法测氮，折算非蛋白氮含量。从总氮中减去氨基酸态氮和非蛋白氮，即得蛋白质态氮含量。通过发酵前、后样品中蛋白质态氮含量的变化，折算蛋白质降解率(%)。

1.7 成品微生物肥料的应用效果试验

按照1.5节得到的最佳发酵条件发酵12 d，将发酵产物于55 ℃干燥，制成成品微生物肥料，并在其有效期内开展应用效果试验。

在事先制好的SK215菌株斜面上加入少量无菌水(水量以刚好浸没菌丝为宜)，制成菌丝液，在旋涡混合器上震荡，使菌丝分散均匀，按菌丝液100 mL、园土1 kg的比例将菌丝液加入原土中，混合翻拌，制成染菌园土。

参照文献[9-10]的方法开展试验。设置4个处理：T1，园土(未染菌，以下不做特殊说明的，园土即指未染菌的园土)+微生物肥；T2，园土；T3，染菌园土+微生物肥；T4，染菌园土。每个处理设置2个平行。每个平行试验对应于1个直径25 cm的塑料花盆，盆内含有1 kg园土或染菌园土。对于处理T1和T3，向1 kg园土或染菌园土中加入20 g制成的成品微生物肥料。各处理下，每盆均播种10粒番茄种子，放在阳光充足的阳台，每隔2 d浇适量水，定期观察各盆种子的发芽情况和幼苗死苗情况，生长30 d时用游标卡尺测量植株地上部高度(株高)，并用天平称量地上部鲜重。

2 结果与分析

2.1 NT-6与SK215拮抗培养试验结果

NT-6与SK215的拮抗培养试验结果显示，NT-6菌株周围有明显的抑菌圈(图1)，说明NT-6可以抑制立枯丝核菌SK215的生长。

图1 NT-6(四点)抑制SK215生长出现抑菌区 Fig.1 NT-6(four dots)inhibits growth of SK215

2.2 发酵条件优化的单因素试验结果

2.2.1 水分含量对发酵产物中NT-6菌量的影响

水分是微生物赖以生存的必要条件，水分含量过低或过高都会影响微生物的生长代谢。发酵产物中的NT-6菌量随着发酵基质中水分含量的升高呈现先增加后降低的趋势(图2)，当水分含量为60%时，发酵产物中的NT-6菌量最多，达1.03×10CFU·g。

图2 水分含量对发酵产物中NT-6菌量的影响Fig.2 Effect of moisture content on NT-6 quantity in fermentation product

2.2.2 肉骨粉与麸皮的配比对发酵产物中NT-6菌量的影响

发酵基质的营养成分会影响细菌的生长繁殖。肉骨粉富含各类营养物质，但其基本呈粉末状，且黏度较大，而麸皮呈干燥颗粒状态。随着麸皮添加量的增多，发酵产物中的NT-6菌量先增加后略降(图3)，当肉骨粉与麸皮的配比为8∶2时，NT-6菌量最大，为2.86×10CFU·g。

图3 肉骨粉与麸皮的配比对发酵产物中NT-6菌量的影响Fig.3 Effect of ratio of meat bone to bran on NT-6 quantity in fermentation products

2.2.3 稻壳添加量对发酵产物中NT-6菌量的影响

NT-6菌株在生长繁殖过程中需要氧气，向发酵基质中添加适当量的稻壳可增加发酵基质的通气量。随着稻壳添加量的增加，发酵产物中的NT-6菌量呈现先增加后降低的趋势(图4)，当稻壳添加量为0.8 g时，发酵产物中的NT-6菌量最大，为6.74×10CFU·g。

图4 稻壳添加量对发酵产物中NT-6菌量的影响Fig.4 Effect of addition amount of rice husks on NT-6 quantity in fermentation product

2.2.4 发酵时间对发酵产物中NT-6菌量的影响

在96 h内，发酵时间越长，发酵产物中的菌量越多，之后微生物代谢趋于稳定，发酵产物中的菌量基本不变(图5)。当发酵时间为96 h时，发酵产物中的NT-6菌量最大，为2.9×10CFU·g。

图5 发酵时间对发酵产物中NT-6菌量的影响Fig.5 Effect of fermentation time on NT-6 quantity in fermentation products

2.3 发酵条件优化的响应面试验结果

利用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken设计水平编码表，以发酵产物中的菌量为考查指标，设计试验，将试验设计与其结果整理于表1。

表1 响应面试验设计与结果Table 1 Response surface design and results

对响应面试验结果进行多元回归分析，得到发酵产物中NT-6菌量的预测值()对自变量(水分含量)、(肉骨粉与麸皮的配比)、(稻壳添加量)、(发酵时间)编码水平的二次多元回归方程，剔除掉非显著项后，拟合的回归方程为=29.05-0.30+012+016+210-137-043+118+029-180-1.37-2.07-7.69。

对拟合的回归方程进行多因素方差分析：回归方程的<0.000 1，而失拟项的=0.179 2>0.05，说明其他因素对试验结果的干扰很小；回归方程的决定系数()为0.999 8，校正的决定系数为0.999 6，说明菌量的实测值与预测值之间拟合度良好，能较好地反映发酵产物中NT-6菌量与4个因素之间的关系。由值判断，4个因素对发酵产物中NT-6菌量影响的显著性从高到低依次为发酵时间>水分含量>稻壳添加量>肉骨粉与麸皮的配比。

响应面越陡峭，平面等高线图越接近椭圆，说明两因素的交互作用越明显，反之亦然。由图6可知，水分含量和肉骨粉与麸皮的配比、发酵时间和水分含量、发酵时间和肉骨粉与麸皮的配比、发酵时间和稻壳添加量交互作用明显，而稻壳添加量和水分含量、稻壳添加量和肉骨粉与麸皮的配比的交互作用不明显。

基于上述试验结果，由软件计算得到的最佳发酵条件如下：肉骨粉与麸皮的配比为7.8∶2.2，发酵时间为99.80 h，水分含量为58.19%，稻壳添加量为0.82 g，在此条件下，发酵产物中NT-6菌量的预测值为2.93×10CFU·g。为了操作方便，将发酵时间改为100 h，其他条件保持不变，经实测，发酵产物中的NT-6菌量为2.92×10CFU·g，与预测值无显著差异，说明优化的发酵条件可靠。

A，水分含量；B，肉骨粉与麸皮的配比；C，稻壳添加量；D，发酵时间。A，Moisture content;B，Ratio of meat bone to bran;C，Addition amount of rice husks;D，Fermentation time.图6 两因素交互作用对发酵产物中NT-6菌量影响的响应面图Fig.6 Interaction of two factors on response surface of NT-6 quantity in fermentation products

2.4 发酵终点确定

发酵过程中，随着发酵时间延长，发酵基质中的总氮含量基本不变，而氨基酸态氮含量和非蛋白氮含量逐渐增加。计算蛋白质降解率，并做变化趋势图(图7)，可以看出，随着发酵时间延长，发酵产物的蛋白质降解率先增加后趋稳。第12天时，发酵产物中的NT-6菌量为2.85×10CFU·g，与响应面试验发酵产物中的最大菌量相当，且蛋白质降解率已基本稳定，因此将第12天确定为发酵终点。

图7 蛋白质降解率随发酵时间的动态变化Fig.7 Dynamics of protein degradation rate

2.5 微生物肥料的应用效果

农作物种子的出芽率其实与微生物肥的联系不大，绝大部分是由种植时的空气、水分、温度和种子的质量等决定的。将4个处理下番茄的发芽和生长状况整理于表2。染菌园土(T4)处理的出芽数最低，死苗数最高，明显受到立枯丝核菌的影响。与之相比，其他处理的出芽数明显提高，而死苗数降低。与未染菌园土(T2)相比，染菌园土+微生物肥(T1)或未染菌园土+微生物肥(T3)条件下，番茄的出芽数、死苗数无明显区别，但株高、鲜重均得到提高，且幼苗长势旺盛，根系较粗较多，而不用微生物肥(T2、T4)的幼苗长势较差，根系较细较少。

表2 不同处理下番茄种子的发芽与生长状况Table 2 Seeds germination and seedling growth of tomato under different treatments

3 讨论

本研究利用患病动物肉骨粉作为主要基质，将NT-6作为发酵菌和功能菌，制备微生物肥料。经单因素试验和响应面法优化，最终确定的发酵工艺条件如下：肉骨粉与麸皮的配比为7.8∶2.2，水分含量58.19%，稻壳添加量0.82 g，发酵时间100 h。在此条件下，发酵产物中的NT-6菌量达2.92×10CFU·g。在前述试验条件下，发酵12 d，制备微生物肥料，所得的成品肥料中NT-6菌量达到10CFU·g以上。

农作物的茎基腐病是由立枯丝核菌引起的。本试验发现，该微生物肥料不但可促进番茄生长，还能减少茎基腐病的发生，降低病死苗的数量。在园土上直接应用该微生物肥料并不能提高种子的发芽率，这可能是由于种子出芽率受土壤营养的影响较小，主要与其自身质量有关。

本研究既实现了肉骨粉的高值化利用，提高了资源利用率，又有效减少了环境污染，实现了废弃下脚料的高效利用，而且工艺简单。

但要说明的是，本研究仍处于实验室研究阶段，若要开展工业化的大规模生产，相关工艺仍需进一步优化。一般来说，微生物肥的应用效果不仅受到原料本身的影响，还与应用时的环境条件相关。当前，作为本试验原材料的肉骨粉品质尚难以控制，因此其大规模生产后的真正使用效果恐与预期效果有差距。这些都还有待进一步的考查与改进。