液相色谱串联质谱在多囊卵巢综合征诊疗中的应用

杨觐瑜

多囊卵巢综合症（PCOS）是在育龄女性中普遍出现的以生殖系统发育异常，以及内分泌与新陈代谢功能失调为特点的临床综合征，通常患病的女性也可由于无法实现正常排卵而发生月经发育异常，更严重的时候甚至会丧失生育能力或发生复发性流产;在此病的影响下又因内分泌与新陈代谢失调，直接导致患者远期新陈代谢紊乱，对患者的身体健康与生命安全带来损害。基于该疾病易导致内分泌及代谢紊乱，而高雄激素血症是诊断该病的主要依据，为此我们认为利用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）可精准检测血液中的雄激素水平，将对PCOS诊断有较好的应用价值。

1液相色谱串联质谱

质谱自1897年问世以来，就是一部多学科的交叉科学进步史，将近有十几项诺贝尔奖包括物理奖以及化学奖在内，颁发给了与质谱技术有关的科学研究和应用，是当代高精尖技术平台之一。目前，液相分离色谱-质谱联用制备工艺方法（LC-MS/MS）已应用于医疗、环境、食物、化学等多个行业;质谱仪研究是指将物质转换为带电粒子，并按照各种物质的质荷比（m/z），把各种待测成分转换到不同的质量分析器来完成样品研究，目前的质量分析器一般包括如下几类：四级杆质量分析器、离子阱质量分析器及飞行时间质量分析器等。在医疗检验领域，由于人体血液或生物样品组成比较复杂，前处理需要纯化和隔离后进行精准的检测，质谱仪拥有比液相色谱更有效的隔离速率和分离度，具有高灵敏度和高特异性特点，且一针进样即可测得多靶标值，目前已作为临床应用检验领域中最有前瞻性和创新性的技术手段之一，在临床应用检测和疾病诊断方面都具有较好的应用价值，也因此高效液相色谱-质谱联用技术代表了当今的精确医学中的精准检测，可以进行多重解析物的同时检测，因此对于健康评价和疾病诊断方面都有着重要意义。

LC-MS/MS分析的临床应用主要在以下几方面：1.全谱氨基酸与全谱维生素的测定方法：因为，全谱氨基酸与全谱维生素在人类之中都处在一个动态平衡点，而一旦这种均衡点被打破，便会引起身体的多种疾病变化。而维生素与氨基酸则在人类中包括了细胞免疫、神经系统、激素生成、营养物质新陈代谢与能源新陈代谢等许多环节构成。所以，其测定方法对保健评估与病症判断均更具意义。时正媛等人采用UPLC-MS/M方法，确定了人类血清中13种氨基酸含量测定方法的新方法，将新鲜血清样本先通过蛋白沉淀前的处理方法，提取上清液后再利用UPLC-MS/MS方法进行分析，分析方法时间短、特殊性强、灵敏度高，为全谱氨基酸检测技术创造了试验基础。2.同型半胱氨酸检测：高同形半胱氨酸（HCY）是引起心脑血管病变的独立风险原因之一。Mccully首先给出了高同型半胱氨酸血症可能导致冠状动脉粥样硬化疾病的假说。该假说认为HCY能引起毛细血管内皮系统的损伤，从而刺激了血管平滑肌细胞的生长，对低密度脂蛋白的抗氧化形成产生负面影响，同时提高血小板功能，从而促使血栓的生成。所以，检测HCY对心脑血管疾病的有效防治和早期治疗有着重要意义。3.类固醇激素检查：类固醇激素是一种弱极化的小分子物质，一般由肾上腺质、胎盘和生殖腺组成，一般包括雄激素、雌激素、孕激素、糖皮质激素以及盐皮质激素等，而类固醇激素的变化也可以作为对内分泌病变等诊断的依据所在，均会导致机体内有关激素水平的变化，如原发性醛固酮增生症、先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征和高雄血症等。所以，对人体类固醇激素技术水平的检测，才能成为疾病诊断的重要基础。高洁等人利用固相含量提取法技术，结合了UPLC-MS/MS，成功建立了五十二种类固醇激素的测定方法，使用电喷雾正/负分子多反应检测模型（MRM），灵敏度较高，基本能够测量在pg级以下，为利用质谱分析法技术确定类固醇激素浓度的临床提供可信证据，打下了基础。4.胆汁酸谱测定：胆汁酸是关键的信息分子，在调控类脂、葡萄糖刺激和人体代谢方面起着主要功能。在肝胆疾病中，由于肝脏合成、代谢和清除以及胃肠消化吸收上的障碍，会影响胆汁酸在各个部位中的含量和分配。而胆汁酸品种也很多，因为其侧链的构造、立体化学性质和氢氧基的数量与位置等差异，表现出多样化甚至相反的生化和生理特性。非乙醇性脂肪性肝脏疾病是一类慢性的发生性肝脏疾病，涉及各种肝损伤，一般是脂类改性、非乙醇性脂性肝炎、纤维化和肝变硬。在非乙醇性脂肪性肝脏疾病中，肝功能胆汁酸代谢和转运蛋白的变化或许会变化最重要的胆汁酸类型，进而直接影响餐后胆汁酸的依赖性信息传递，和调控肝炎症级联反应速度。肝细胞癌为最常见的原发性高血压肝癌类型，占所有该类恶性肿瘤的80%～90%。研究表明，鹅去氧胆酸、去氧胆酸、石胆酸等胆汁酸成分，能对肝肾中星形细胞（HSCs）内NLRP3炎性细胞小体的活力产生双向调控，进而直接影响肝细胞癌生成。胆汁酸谱检测适合慢性肝病、病毒性肝炎、肝硬化、胆囊炎、胰腺炎、肝癌、肝胆胰外科手术患者等。

2多囊卵巢综合征

多囊卵巢综合征（PCOS）为育龄女人中较普遍的，以月经周期失调、排卵障碍、内分泌和代谢紊乱并伴发多囊卵巢（PCO）为主要症状的临床综合征，于1935年由Stein和Leventhal最早报告故也简称为Stein—Leventhal综合症，据国外报告在育龄妇女中的发生率仅为5%-10%，据中国报告则为百分之五点六;高发年龄段约为20～35岁;目前该病的原因和发生机理尚不清楚;但与基因和环境因素有关，并包括神经系统内分泌和免疫的复杂调节。家系分析结果显示，虽然PCOS呈常染色体遗传或x染色体连锁显性遗传，但并不全部遵循孟德尔的遗传规则。PCO S也是一种基因组病，目前的侯选物基因研究对象还有牛胰岛素副作用有关基因组、高雄激素有关基因组和慢性炎症因子有关基因等。同时，环境因素也参与了PCO S的形成、进展。尤其是在宫内高雄激素的过多环境、环境内分泌影响物如双酚A、持久性的有机污染如多溴联苯（PCBs）、抗癫痫药、营养过剩和不良生活方式等都可以提高PCOS发病的危险性。在美国，与PCOS相关的医疗费用每年预估为11.6亿美元。

PCOS临床是一种复杂性多样的、多系统的慢性内分泌机能阻碍，如经期反常、多毛、痤疮以及伴随肥大症、高脂血症、过多雄活性激素化等的各类症状，囊状卵泡、胰岛素抵抗、不孕症和流产等，但大部分患者都仅明显体现其中一些，临床应用异质化也是目前缺乏统一治疗规范的主要因素。对于PCOS疾病的检查，主要通过临床表现、超声影像以及内分泌特征来诊断。目前，PCOS最广泛使用的三大诊断标准是鹿特丹标准、NIH标准，以及AES标准。

1990年的由美国国家卫生研究院（NIH）制定的NIH指标包括（1）高雄性素的药物临床治疗和/或高雄激素血症;（2）慢性无排卵;（3）排除了具有这些病变中的某些有关病变，如高泌乳素血症和甲状腺病变、先天性肾上腺皮质增生等。需注意的是，在该检查标准中，卵巢为多囊样的结构改变（PCO）并没有被用作检查的客观准则，并且该规范也没有对规范的每一项内容进行具体阐述。

2003年，由欧洲人生殖健康和胚胎发育学会（ESHRE）与美洲生殖医学学会（ASRM）举行的鹿特丹PCOS专项大会对NIH诊断规范做出了修改，并制订了"PCOS鹿特丹诊断规范"。成为全世界最广泛使用的规范，鹿特丹对PCOS的定义如下：（1）排卵过少或无排卵;（2）存在对较高水平雄性素的临床治疗和/或生物学危害;（3）超声检查到女性卵巢多囊样的改变，女性卵巢容积≥10mL（女性卵巢容积=0.5×长×宽×厚），和/或同一条切面上口径为2～9mm的卵泡数≥12个。在上述三条中最大的前二项条件得到满足而排除了其他病变时，即可开展PCOS检测。鹿特丹号标准在原NIH标准表型上增加了PCO这一技术指标，是对原标准的进一步延伸，并将使确诊为PCOS的目标人群比重大幅度地增加。

2006年，美国雄激素水平过多学会（AES）所制定的AES规范，对PCOS的界定如下：高雄激素血症的先决条件，有排卵过少/无排卵，并排除其他有这些症状的疾病。AES标准涵盖的患者范围比NIH标准更广泛，但比鹿特丹标准要窄。

随着科学研究的开展，有研究人员证实了东南亚种族和欧美人种之间在血清雄激素水平、临床高雄性素水平表達、新陈代谢状况等方面有着显著的人种差别。2008年，卫生部门开始研究建立"多囊卵巢综合征诊断标准"以形成更符合于我国人群的治疗规范，2011年出台基于有关文献和面向我国人的循证医学研究成果的《PCOS确诊和防治技术专家合作共识》。该标准对PCOS的危害原因、症状等作出了定义，并标准了辅助检查和实验室检查方法，是由卫生部门统一颁布的标准文本，广泛应用于我国各个医学行业，具备了权威性、实用性和重要的临床指导意义。与国外规范不同，我国多囊卵巢综合症检查规范第一次明确提出"疑似PCOS"这一定义。该规范认为，经期稀发、闭经及不规则子宫出血是检查的必要要求。另外，如再符合下列二项中的条l项，也可能诊断为疑似PCOS病：（1）高于正常雄激素水平的临床或血症;（2）超声波检测结果显示为PCO。在满足以上的疑似PCOS确诊要求以后还需要逐一排查任何可以导致高安特灵水平的病症，以及导致排卵异常的病变方可明确诊断。

2018年，由中华医师总会内分泌物细胞代谢素科医学分部制定的《多囊卵巢综合征治疗内分泌物专业合作意见》中华医学会妇产科专业学分会内分泌学组制定的《多囊卵巢综合征国家治疗指引》，均通过了2011年的有关PCOS的诊断规范。

高雄激素血症在PCOS的病理过程中起着重要作用，被认为是PCOS最稳定和最重要的诊断组成部分。然而，哪种雄激素检测来辅助诊断PCOS仍然存在一定争议。临床上，人们普遍地把血清中总睾酮增高程度视为高雄激素血症的主要诊断标准，但是事实上只有游离睾酮和部分与白蛋白以非特异性或最低亲和度结合的总睾酮，才是真正有生物效性的总睾酮。常规检测血清中总睾酮水平的方法并不能确定为高雄激素血症的最灵敏指标。理想状况下，建议应用于新鲜的血清睾酮（T）、雄烯二酮（AD）、硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）、或二氢睾酮（DHT）和17-羟孕酮（17-OHP）的水平来评估女性过度雄激素的起源和程度。北京市妇产医院检验科根据曹正教授等人的研究，进行了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）同时对睾酮（T）、雄烯二酮（AD）、硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）、二氢睾酮（DHT）和17-羟孕激素（17-OHP）进行定量分析的方法。根据国际临床与实验室指导标准研究所（CLSI）指南EP28-A3C，采用非参数方法结果表明，部分PCOS患者仅出现非T雄激素增加，因而同时定量这四种雄激素在PCOS诊断中的潜在临床效用很高。

患有PCOS的女性中，不仅卵巢分泌的雄激素增加，且高达50%的患者DHEAS水平也升高。在女性中，DHEAS几乎都是由肾上腺分泌的，睾酮来自卵巢25%、肾上腺（25%）和其他雄激素的外周转化。有研究比较了DHEAS/睾酮比率对PCOS患者代谢参数的影响，他们都指出，具有高DHEAS/睾酮比率的PCOS患者具有更有益的代谢特征，使用DHEAS/睾酮比率有利于评估PCOS患者的代谢风险。

对PCOS的进一步检查还需要排查其他有关病变，如高泌乳素血症和副甲状腺病变、肾上腺皮质增生等。二十一羟化酶缺乏非典型肾上腺增生病（NC-CAH）是一个很常见的常染色体隐性遗传综合征，NC-CAH的主要临床特征为多毛症、排卵性和月经功能障碍，另外还有胰岛素抵抗和多囊卵巢形态。仅基于临床表现，很难区分NC-CAH与PCOS。在一篇回顾性比较PCOS和NC-CAH的文章中，平均41.87%的NCAH患者和25%的PCOS患者显示血清17-OHP水平升高，这是区分这两种综合征推荐的筛查指标。相比之下，T和DHEAS等常见的雄激素在NC-CAH中也有所升高，但是在区分NC-CAH和PCOS方没有太大意义。考虑到测量17-OHP作为排除NC-CAH的广泛接受度，因此临床实验室可以方便地将其纳入用于PCOS诊断的雄激素中。

一项前瞻性研究表明，如果AD包含在雄激素检测通道中，对PCOS的诊断率可增加约9%。DHT由T经5α还原酶作用形成，与雄激素受体结合的亲和力更高，使DHT在其靶细胞中更活跃。所以，DHT是PCOS病人高雄激素血症检测与处理中的主要靶向雄激素之一，这也表明T+DHT检测在PCOS鉴别方面优于任何单一雄激素。由此可见，在PCOS诊断过程中，T、AD、DHEAS和DHT的组合测定提供了更好的诊断能力，同时对17-OHP的测定还可以排除NC-CAH的影响。对雄激素的组合测定，用于评估女性过度雄激素的起源和程度，对临床医生进行PCOS诊断提供有力支持。

3质谱技术在多囊卵巢综合征中的应用

因为类固醇激素分子结构相似，而大多数活性激素在人体内的浓度极微，且一般测定水平都在nmoL/L至pmoL/l数量级之间，故精密定量分析类固醇活性激素对仪器设备的敏感度和方法的精度都有很大的需求。目前，类固醇激素的检测方式主要有化学免疫技术、液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）、气相色谱-质谱联用方式。二十世纪以前，传统化学免疫法由于操作简便快捷，在临床上广泛应用。但传统的化学免疫法也具有许多弊端：一是对敏感度低下，在样品含量很低时，就要求用很大的样本量富集、提纯;二是适用性较差，待测物的抗体易与和分子结构相同的内源性化合物以及代謝产物形成交叉反应，从而形成假阳性结果;三是分析效能低下，一般人一次只检测一种化学物质，就无法同时完成几种激素的定性与定量分析。所以，化学免疫法已逐步被生物色谱法所取代。气相色谱-质谱联用技术敏感度较高，但通常要求苛细的衍生化过程和较长的分析时限（通常≥30min），而且目前没有一个适合于各种类固醇激素的衍生化试剂。而LC-MS/MS则减少了传统气相色谱法中苛细的衍生化过程，而且特异性较强，可以很好地消除对基质中类似结构化合物的影响，是各种类固醇激素中目前最安全的测定方式。另外，对LC-MS/MS的敏感度也最高，可以达到临床实验室中大多数类固醇激素的测试条件，并且通量高，可以一次检测类固醇激素整条代谢通路，提供了更加丰富的诊断依据。值得注意的是，2013年美国内分泌学会指出：对于具有高影响力的临床研究，类固醇免疫分析时代正逐渐接近尾声。自2015年1月1日起，投稿至临床内分泌与代谢杂志的性激素数据必须来源于质谱法检测。预计基于质谱法检测的要求未来将扩展到肾上腺类固醇激素和维生素D。

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