羊口疮病毒内蒙古株的分离与初步鉴定

王 娜，戴伶俐，乌云塔娜，秀 春，赵世华，达来宝力格

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；2.呼伦贝尔市新巴尔虎右旗动物疫病预防控制中心，内蒙古 新巴尔虎右旗 021300；3.呼伦贝尔市新巴尔虎右旗农牧业事业发展中心，内蒙古 新巴尔虎右旗 021300）

羊口疮（orf）是由羊口疮病毒（orf virus，ORFV）引起的一种急性接触性人畜共患传染病，主要感染绵羊和山羊，羔羊的发病率可达到90%以上，且极易引起继发感染或混合感染， 致使羔羊的死亡率升高，给养殖场带来巨大的经济损失［1-2］。 我国将该病列为三类动物疫病之一［3］。 该病呈地区性流行，我国黑龙江、新疆、陕西、云南、江苏、安徽等地均有羊口疮疫情的报道［4-9］。

ORFV 属于痘病毒科副痘病毒属， 病毒粒子约为280 nm×170 nm， 常呈椭圆形， 偶呈球形、锥形，表面有囊膜包被。该病毒为DNA 双链病毒，长约140 kb，G+C 含量约64%， 包括16 个开放阅读框，由130 个编码基因组成。 在ORFV 基因组中，BamHⅠ酶切片段的B2L 基因是一个完整的阅读框，全长为1 137 bp，编码42 kDa 蛋白，该蛋白是病毒囊膜的重要成分，能刺激机体产生抗体，且是ORFV 的优势抗原之一， 可作为ORFV 分子生物学鉴定的靶基因。 为确定引起内蒙古地区规模化养殖场发生疑似羊口疮的病原， 笔者采集发病羊只的口鼻痂病料，采用常规病毒分离方法、电镜观察方法及分子生物学方法对分离到的疑似ORFV毒株进行鉴定， 以期为该地区养殖场控制羊口疮的发生及流行提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 待检病料

从内蒙古呼和浩特市某规模化养殖场采集疑似羊口疮病羊的口鼻痂病料3 份， 从呼伦贝尔市某规模化养殖场采集疑似羊口疮病羊的口鼻痂病料4 份，共7 份待检病料。

1.1.2 细胞及疫苗

山羊皮肤成纤维细胞 （goat skin fibroblasts，GSFs）， 购自中国科学院昆明动物研究所细胞库；羊口疮弱病毒细胞冻干活疫苗， 购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司。

1.1.3 主要试剂

DMEM 低糖培养基、胰酶、胎牛血清、双抗、DMSO，购自北京索莱宝科技有限责任公司；病毒DNA 提取试剂盒，购自碧云天生物技术有限责任公司。

1.1.4 主要仪器设备

高速离心机（型号：pico 17）、CO2培养箱（型号：Thermo311），赛默飞世尔科技（中国）有限责任公司产品；恒温水浴锅（型号：SH-WB-6GDN3），韩国三兴有限责任公司产品；PCR 仪 （型号：ABI9902）、电泳仪（型号：HE99X）、全自动凝胶成像仪（型号：Type T2A），美国伯乐有限责任公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 病料样本灭活

将采集的病料样品置于56 ℃的恒温水浴锅中热灭活30 min。

1.2.2 病毒分离

1.2.2.1 病料处理

采集病羊口鼻结痂并剪碎、研磨，加入5 倍体积的0.01 mol/L PBS 缓冲液， 加2 000 IU/mL 青链霉素，制成悬液。4 ℃过夜，3 000 r/min 离心10 min，上清液用0.45 μm 滤器过滤备用。

1.2.2.2 病毒分离培养

取病料上清液200 μL 接种于含有生长良好GSFs 的96 孔板，37 ℃吸附2 h，期间摇动3～6 次，吸附完毕弃去上清液， 每孔加入2 mL 的维持液，37 ℃CO2培养箱中培养。 每天观察细胞病变，当80%细胞出现病变时，将细胞经-80 ℃反复冻融3次，连续传代3 次。

1.2.3 病毒鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定

取分离毒株悬液3 000 r/min 离心20 min，取上清液，用1%磷钨酸溶液进行电镜负染，观察形态学特征。

1.2.3.2 分子生物学鉴定

使用病毒DNA 提取试剂盒提取病毒基因组DNA， 操作按试剂盒说明书进行。 根据NCBI 上ORFV 的免疫囊膜蛋白基因B2L 的编码序列（登录号：GU320351）， 利用Premier 5.0 生物学软件设计PCR 扩增引物。 上游引物B2L（F）序列：5′-CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC-3′， 下游引物B2L（R）序列：5′-CCAAGCTTTTAATTTATTGGTTTGCAGAACT-3′，预期目的片段大小为1 137 bp。 PCR 扩增体系为50 μL：mix 酶25 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，无酶水21 μL。PCR 反应条件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃70 s，30 次循环；72 ℃10 min。 阴性对照为正常GSFs 培养液， 阳性对照为羊口疮弱病毒细胞冻干活疫苗。 PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后，低温寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。 利用NCBI 的BLAST 数据库进行序列比对，利用MegAlign 软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

7 份病料接种于GSFs， 仅有3 份在培养2 d时出现细胞病变，培养至4.5 d 时80%左右的细胞出现病变。接种阳性病料的GSFs 出现圆缩、团聚、间隙变大，最后拉网脱落（见图1b），正常GSFs 未出现病变（见图1a）。共分离到3 株疑似ORFV，分别命名为NM-ORFV-1 株、NM-ORFV-2 株、NMORFV-3 株。

图1 正常GSFs 和接种阳性病料后病变GSFs 形态

2.2 病毒电镜观察结果

病毒经负染后在电镜下观察呈卵圆形 （见图2a、图2b），病毒粒子长220～250 nm，宽125～200 nm， 符合ORFV 粒子的形态特征且与文献描述的大小形态一致，因此，将其初步确定为ORFV。

图2 NM-ORFV-1 株病毒粒子电镜下形态

2.3 病毒分子生物学鉴定结果

以病毒基因组DNA 为模板进行B2L 基因PCR 扩增，获得1 137 bp 的扩增产物（见图3），与预期大小一致。 阳性扩增产物测序后，通过NCBI的BLAST 比对，构建系统发育树（见图4），并进行同源性分析（见图5）。 结果显示，NM-ORFV-2 株与NM-ORFV-3 株遗传关系密切，处于同一分支，且与ORFV KP336704（中国）分离株的亲缘关系最近，同源性达到99.4%；NM-ORFV-1 株与NMORFV-3 株及NM-ORFV-2 株处于不同分支，NM-ORFV-1 株与NM-ORFV-3 株的同源性为99.0%，NM-ORFV-1 株与NM-ORFV-2 株的同源性为99.1%， 且NM-ORFV-1 株与JQ904789 （中国）疫苗株亲缘关系最近，同源性为99.6%。

图3 ORFV 分离株B2L 基因PCR 产物扩增电泳图

图4 基于B2L 基因序列的ORFV 分离株系统发育树分析

图5 基于B2L 基因序列的ORFV 分离株同源性分析

3 讨论

羊口疮在全球盛行，常呈群发性流行。该病虽然死亡率不高，但导致羊只生产性能降低，出栏减缓，给养羊业造成了一定经济损失。 同时，该病是人畜共患病，可以感染养殖人员，对人类健康造成危害。 目前该病尚无有效的治疗药物，因此，预防和早期诊断是至关重要的。

为了深入研究ORFV， 研究者选择不同种类的原代细胞及细胞系分离ORFV。 最早发现原代羔羊睾丸细胞及羔羊肾细胞可用于ORFV 的增殖，之后发现犊牛睾丸原代细胞、羔羊真皮细胞及胎牛肾细胞等细胞系均可用于ORFV 的增殖［10-12］。多名学者使用HELA 细胞［13］、MDBK 细胞［14-16］、羊胚胎鼻上皮细胞［17-18］、羊睾丸细胞［19-21］、VERO 细胞［5，22］等成功分离到了ORFV。该研究使用VERO、MDBK、BHK21 细胞在前5 代盲传中均未观察到明显病变， 在使用GSFs 接种后48 h 出现明显病变，通过测序确认了引起GSFs 病变的是目标病毒ORFV。 这可能与不同毒株致病力的差异有关，某些样本来源的毒株在传代细胞上病变不明显，不易被分离到， 而临床样本中的病毒更适应羊源原代细胞［11］。

该研究分离到的3 株ORFV 病毒亲缘关系密切，NM-ORFV-2 株与NM-ORFV-3 株处于同一分支， 同源性为100%；NM-ORFV-1 株与NMORFV-2 株及NM-ORFV-3 株处于不同分支，与二者的同源性大于等于99.0%。 系统进化树分析提示， 该研究分离得到的ORFV 毒株可能是国内的流行株，为ORFV 的后续研究提供了参考。