绵羊肺炎支原体分子致病机理研究进展

戴伶俐，王 娜，张 帆，宋 越，白 帆，刘 威，杨 斌，赵世华，张月梅

（内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

支原体（Mycoplasma）是介于细菌和病毒的原核微生物，无细胞壁成分，具有较强的吸附能力和延展性，能通过细菌滤器，并且能在体外无细胞条件下生长繁殖［1］。 支原体种类众多，包括肺炎支原体、无乳支原体、解脲支原体等。 肺炎支原体常引起慢性、持续性感染，难以清除。 绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是引起绵羊和山羊传染性肺炎的主要病原体， 患病羊临床表现为咳嗽、流涕、气喘、渐进性消瘦以及肺脏间质增生性炎症，常呈隐蔽性、持续性感染。 羊支原体肺炎是高度接触性传染病， 通过空气飞沫传播进入宿主机体，经黏附作用定植于呼吸道黏膜［2］，造成持续性感染， 羔羊尤为易感， 发病率和死亡率较高，患病羔羊肺脏呈典型的胸膜肺炎病变，肺脏炎性渗出增加，肺脏与心包膜、膈膜、胸腔壁内膜粘连，肺脏病灶萎缩呈暗红色，伴有呼吸道支气管炎症状［3］。 支原体能够抑制宿主免疫系统，降低天然免疫细胞杀伤能力，使外周T 淋巴细胞、B 淋巴细胞数量减少，使之逃避免疫系统监控和清除［4-6］，因此，MO 感染成年羊常呈现慢性经过［7］。 妊娠期、哺乳期母羊感染MO，呈现持续性混合感染，造成羔羊感染率上升，增加羔羊发病率和死亡率［8］，MO使成年羊持续性感染、羔羊病死率增加［9］，严重影响羊生产性能， 造成较为严重的经济损失，MO 引起的绵羊支原体肺炎是影响养羊业健康发展的重要呼吸道疫病。 因此，深入了解MO 的致病机制，是研发有效疫苗、 检测方法、 治疗药物的重要前提。随着养羊产业的不断发展，对该病的重视程度越来越高，近年来，在致病机理方面的研究取得一定进展。 笔者对MO 分子致病机制研究进展进行综述，以期为后续深入研究MO 致病机制、开发新型防控技术奠定基础。

1 MO 黏附呼吸道上皮细胞的分子机制

肺炎支原体入侵宿主的第一步是黏附［2］。 位于支原体顶端的黏附素或黏附因子是支原体的主要毒力因子。 关于人肺炎支原体和猪肺炎支原体黏附呼吸道上皮细胞的分子机制， 已经进行了大量的研究和验证工作。 研究表明，P1 和P30 蛋白是人肺炎支原体主要的黏附因子， 也是最早研究的、作用机制比较明确的黏附因子［10］。对于动物肺炎支原体， 猪肺炎支原体的研究相对较早也较为广泛和深入。 研究发现，P97 蛋白首先被证明是猪肺炎支原体的主要黏附因子［11］。随后，P102、P146、P216 蛋白都被证明与黏附相关，由此可见，支原体对呼吸道上皮细胞的黏附并不是由某个单一蛋白完成，而是需要一系列蛋白协同完成黏附。对人肺炎支原体的研究发现，HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、P65、P40、P24、P41 等蛋白都与黏附过程相关，辅助P1 和P30 蛋白实现支原体黏附宿主细胞。 对于MO 黏附因子的研究目前仍处于起始阶段。根据序列比对分析结果推测MO 的P113 蛋白与猪肺炎支原体黏附蛋白P97 直系同源［12］，可能与MO 黏附相关， 但是其是否属于黏附蛋白目前尚缺少有力的直接证据。 对于MO 黏附相关蛋白的研究仍在探索。随着基因组测序技术的发展，研究人员利用第二代测序技术对MO 进行全基因组测序，通过生物信息学分析，预测其蛋白质功能，从而分析得到与黏附相关蛋白， 如P130、P129 和P71［13］。 但是这些蛋白具体执行何种功能、是否存在互作、在MO 中的定位均需要深入研究。

2 MO 引起下呼吸道损伤的分子机制

MO 通过黏附呼吸道上皮细胞定植于呼吸道黏膜和肺泡细胞表面，持续刺激机体，造成机体炎性损伤。研究人员通过体内外试验探究MO 引起下呼吸道损伤的分子机理。在体外研究方面，Li 等［14］通过气液界面培养宁夏滩羊气管上皮细胞， 接种MO， 证实MO 通过ERK-线粒体途径引起细胞凋亡。 Xue 等［15］使用气液界面培养方法培养绵羊气管上皮细胞感染MO，表明MO 可通过Toll 样受体激活其级联蛋白MyD88，使下游P38 蛋白磷酸化，进而通过MAPK 信号通路导致线粒体活性氧（ROS）累积，引起气管上皮细胞氧化应激。 内源性ERK-线粒体途径和外源性凋亡途径均发挥作用，细胞发生凋亡致使气管上皮损伤［14，16-19］。进一步研究发现，MO 菌体最外层的荚膜多糖（capsular polysaccharides，CPS）能够在体外刺激原代羊气管上皮细胞发生氧化损伤。 CPS 是MO 的重要毒力因子，通过TLRs 通路，MyD88 依赖性和非依赖性信号转导使细胞凋亡，JNK/P38-MAPK 信号通路起重要的促凋亡作用［15］。在体内研究方面，Du 等［20］建立了绵羊MO 体内感染模型， 肺脏转录组分析表明MO 通过LAMP-TLR2/LR6-MyD88-MKK6-AP1 -IL1β 和 LAMP -TLR8 -MyD88 -IRF5 -RANTES 两条通路致肺部病变。 促使细胞自噬也是MO 引起细胞损伤的一种方式。 罗海霞等［21］研究表明，MO 通过P62 和Atg7 蛋白引起绵羊肺上皮细胞自噬。

MO 不仅通过内源性和外源性凋亡途径促使呼吸道黏膜上皮细胞凋亡导致组织损伤， 还能通过刺激免疫细胞促进炎症反应， 使组织发生炎性损伤而致病。 MO 菌体表面的脂质膜相关蛋白（lipid-associated membrane proteins，LAMPs） 是与宿主细胞发生相互作用的重要结构［22］。 最近证明MO 可通过LAMPs 与绵羊肺泡巨噬细胞的TLR2受体结合激活MAPK 信号通路，上调IL1β 炎症因子表达，使其分泌水平提高［23］。 IL1β 既是炎症因子又是信号分子，能募集其他免疫细胞，包括天然免疫细胞（如中性粒细胞和树突状细胞）和适应性免疫细胞（如T 淋巴细胞、B 淋巴细胞），从而激发更严重的炎症反应［24］。此外，MO 还能通过LAMPTLR2-NF-κB/MAPK-cytokine 通路引起小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应［23］。MO 的热休克蛋白（HSP）也是引起炎症反应的重要刺激因子。 周怡等［25］研究表明， 重组MO HSP70 蛋白能引起小鼠IL-2 和INF-γ 分泌水平上升。

MO 感染羊肺上皮巨噬细胞的蛋白质组学研究表明，MO 感染引起Toll 样受体信号通路相关蛋白 （FADD、CD86 等）、MAPK 信号通路蛋白（p38、ERK 等）、 自噬作用相关蛋白（CD11b、PKC等）及细胞与细胞外基质（ECM）受体相互作用相关蛋白（THBS1、CD36 等）表达量发生显著变化。这些蛋白分子主要参与巨噬细胞的免疫应答、凋亡及自噬等过程。从蛋白质组学角度证明，绵羊原代肺泡巨噬细胞感染MO 后其Toll 样受体信号通路、MAPK 信号通路、ECM 受体相互作用及自噬作用途径可能被激活或被抑制［26］。

由此可见，MO 对下呼吸道造成的损伤机制主要是引起肺上皮和气管上皮细胞凋亡， 同时刺激巨噬细胞发生严重的炎症反应， 对附近组织造成炎性损伤。支原体不仅损伤呼吸道上皮细胞，也能影响免疫系统，从而造成更严重的炎性损伤。

3 MO 抑制宿主免疫系统的分子机制

免疫系统是机体抵抗病原微生物的重要防线。 支原体感染多呈现慢性、持续性感染，对机体造成持久性损伤［27-31］。 支原体是如何与宿主机体免疫系统对抗、如何逃避免疫监视而免受清除，成为近年来支原体研究领域的热点。

天然免疫是动物抵抗病原微生物的第一道防线，中性粒细胞作为数量最多的天然免疫细胞，在感染初期发挥极为重要的抗感染免疫作用。 中性粒细胞能通过吞噬、 呼吸爆发作用等实现对病原微生物的清除。 但是支原体能抵抗中性粒细胞的吞噬作用，降低其细胞外捕网（NETs）活性，抑制诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和一氧化氮产生，减弱其呼吸爆发作用，从而抑制中性粒细胞的功能活性而侥幸生存［4］。 此外，巨噬细胞作为天然免疫系统的重要组成部分，通过吞噬、抗原递呈、分泌炎性因子、分泌补体等方式抵抗微生物感染［32-34］。MO 可引起小鼠肺巨噬细胞凋亡。 研究表明，P53 和RO 介导的内源性凋亡途径和caspase8 介导的外源性凋亡途径均可引起小鼠肺巨噬细胞凋亡，抑制天然免疫反应，降低机体对菌体的抵抗能力［35］。 TIPE2 蛋白在支原体感染引起的巨噬细胞炎症反应过程中起负调控作用，可抑制巨噬细胞的免疫反应［36］。 近年来，新发现的巨噬细胞自噬现象， 不仅能发挥清除病原微生物的作用，而且能被病原微生物利用，从而达到免疫逃逸目的［37］。 MO 进入巨噬细胞后形成内体（endosome），激活NOD/c-JNK 通路，形成自噬小体（autophagsome），在溶酶体的作用下使巨噬细胞发生自噬，Atg5、beclin1 和LC3-II 自噬相关蛋白表达均上调［26］。 MO 可引起巨噬细胞自噬，从而降低巨噬细胞的防卫能力。 巨噬细胞不仅在天然免疫反应中发挥重要作用， 而且其分泌的细胞因子能够募集、活化适应性免疫细胞，因此，巨噬细胞是天然免疫和适应性免疫的桥梁， 一旦其功能受阻，机体的免疫功能将发生严重失调，降低机体免疫能力。另外，一个在天然免疫系统和适应性免疫系统中均发挥作用的分子——补体也能够被支原体巧妙躲避。 肺炎支原体通过EF-Tu 募集H 因子，逃避补体杀伤。H 因子还有助于支原体与气管上皮细胞黏附［38］。

支原体不仅能够抑制天然免疫细胞功能，还能通过影响适应性免疫系统达到逃避免疫监视的效果。 肺炎支原体感染使外周血CD4+T 细胞数量以及CD4+T 细胞与CD8+T 细胞比例降低。 感染MO 的Argali 杂交羊肺脏转录组分析表明，MO 能抑制纤毛运动， 使B 细胞免疫抑制， 致使其易感MO［39］。 不同品种羊对MO 的易感性存在一定差异， 这也促使研究者从不同的角度探讨MO 与免疫系统的互作方式。 羊MHC-DRB1 外显子exon2区域多态性与是否易感或耐受MO 感染有关［40］。

4 小结与展望

由于MO 引起的羊支原体肺炎呈渐进性发展，降低羊生产性能，难以有效防控，该病也受到越来越多的关注，对MO 的研究将逐渐深入。 黏附是支原体发挥致病作用的第一步， 多种支原体的黏附蛋白已经明确。 对于MO，虽然已经推测或间接证明与其黏附相关的蛋白， 但是目前仍然缺乏有力的直接证据， 例如通过构建缺失株或筛选缺陷菌株直接证明与支原体黏附功能相关的蛋白。

目前对于MO 引起细胞损伤的分子机制研究集中在TLR 受体及其下游相关信号通路，如MAPK、ERK、JNK 信号通路，最终引起氧化应激、凋亡或者自噬。 支原体能通过抑制宿主免疫系统包括天然免疫和适应性免疫， 达到免疫逃逸，造成持续性感染。 对MO 与免疫系统的互作机制进行深入研究，有利于有效清除MO，降低其持续感染率。

支原体不同于细菌与病毒， 有特有的形态结构、生长特性、致病机制。 对于支原体分子致病机制在人肺炎支原体、牛肺炎支原体、猪肺炎支原体研究上较为广泛与深入。 对于MO 的研究方兴未艾， 由于缺少便于操作的体外模型和基因组操作系统，对于科学假设缺乏有效的验证系统，也限制了对该病原菌的深入研究。 羊呼吸道疾病目前情况复杂，往往并不是单一病原微生物引起，常呈现复杂的混合感染［41-44］。免疫巴氏杆菌LKTA 亚单位疫苗能够对该病原菌起到免疫保护作用， 但是对支原体混合感染缺乏有效的保护［45］，支原体与其他呼吸道病原菌的互作关系也将是解析该病致病机制的新思路。 因此，建立有效的体外评价体系、高效基因组操作系统会大大提升对该病原体的认知，有利于开发高效防控技术。