动植物miRNA 实现跨物种基因调控的研究进展

孟桂智，刘宝宝，李雅辉，马燕芬，王兴平，马 云，蔡小艳

（宁夏大学农学院/宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室，宁夏 银川 750021）

microRNA （miRNA） 是一类含有18～24 个核苷酸的内源性非编码单链小RNA 片段，属于转录后水平的调控因子［1］。 研究人员在秀丽隐杆线虫体内发现了Lin-4， 它只编码小RNA 而不编码蛋白质，这类物质后来被称为miRNA；Lin-4 通过与其靶mRNA 的3′端非编码区结合抑制靶基因的表达从而发挥作用［2］。 Zhang 等［3］研究发现大米中的miR-168a 能够被消化道吸收进入肝脏，靶向作用于LDLRAP1，导致小鼠血浆中的低密度脂蛋白含量升高，由此引发人们对跨界miRNA 的研究兴趣。 随后发现， 金银花中的miR-2911 可以抑制PB2 和NS1 基因的表达从而有效抑制流感病毒的复制，降低小鼠肺组织中的病毒滴度［4］。 随着研究的不断推进发现，动物源性的miRNA，如鸡蛋中的miRNA 具有跨物种调控人体功能的作用［5］，并且发现牛奶外泌体中的miRNA 有类似功能［6］。 后期也有研究表明动物乳汁外泌体中的miRNA 也具有一定的调控作用， 例如牦牛乳来源的外泌体miRNA 可在缺氧环境中调节肠上皮细胞增殖［7］。与此相关的miRNA 结构、跨物种后稳定性、靶基因结合等方面的研究逐渐增加。 笔者对植物和动物miRNA 跨物种调控的研究进展进行系统和全面总结， 以期为后期深入探究其跨物种功能机制提供参考。

1 动植物miRNA 的结构及结合靶基因的方式

1.1 miRNA 生物合成过程

动物体内编码miRNA 的基因主要存在于细胞核中，编码基因首先经RNA 聚合酶Ⅱ或Ⅲ进行转录， 形成一个具有特殊茎环结构的初级转录本（pri-miRNA），经腺苷酸化后形成多聚腺苷酸尾巴和类似mRNA 的帽子结构。 pri-miRNA 在细胞核内被Drosha 酶剪切后去掉两边多余的序列形成miRNA 前体 （pre-miRNA），pre-miRNA 被Exportin-5 转运蛋白呈递至细胞质中，在Dicer 的作用下进一步剪切形成具有不完全配对的双链RNA， 最后在RNA 解旋酶的作用下形成成熟miRNA 和miRNA*，成熟miRNA 可与多种蛋白质结合，从而形成miRNA 诱导的复合物RISC，可使基因沉默［8］。

植物中miRNA 的形成过程与动物miRNA 形成略有差异，植物体内不含Drosha 酶，由与其具有相似功能的DCL1 代替， 因此，pri-miRNA 经DCL1 剪切形成pre-miRNA，pre-miRNA 在DCL1酶剪切后形成长度为20 bp 左右的成熟miRNAmiRNA* 双链复合物； 由HASTY （具有类似Exportin-5 转运蛋白功能）从细胞核转运到细胞质中，最后在Helicase 酶的作用下形成单链成熟的miRNA 并与AGO 等蛋白结合，形成有功能的复合物［1，9］。 动植物miRNA 生成过程虽存在差异，但都形成有功能的复合物发挥其稳定的生物学功能。

1.2 miRNA 结构特点及跨物种存在的稳定性

miRNA 是生物体内普遍存在的一种内源性非编码单链RNA， 其前体具有特殊的发夹结构，这种发夹结构不仅包括传统的碱基配对形式G：C、A：T（U）配对，还存在大量的G：U 碱基配对。 成熟miRNA 的5′端为磷酸基团，3′端为羟基， 动物的成熟体miRNA 及其前体序列在进化上相对保守，而植物miRNA 仅仅是其成熟体较为保守。 动物miRNA 前体的序列长度为60～80 个核苷酸，而植物miRNA 前体的长度变化较大，从几十个碱基到几百个碱基［10-11］。

动植物miRNA 在结构上存在的最大区别是植物miRNA 3′末端具有2′-O-甲基化修饰， 不仅能增强miRNA 的稳定性，还能保护甲基化修饰的miRNA 不会被核酸外切酶降解。 此外，甲基化修饰的miRNA 对氧化剂高碘酸钠具有抗性［12-14］，因此，可利用这一特性区分动植物miRNA。 甲基化修饰的miRNA 不易被降解， 体现在植物miRNA跨物种存在于动物体内，例如用地黄水煎剂灌喂小鼠，在小鼠的血液中发现了地黄源性的miRNA［15］。通过模拟人类消化系统处理煮熟后的大米和大豆， 虽然大米和大豆源性的miRNA 含量存在衰减，但仍然具有生物学活性［16］，这一现象的发生主要是因为植物中的miRNA 具有甲基化修饰，对热稳定，并且耐受消化道的酸性环境，动物采食消化后被小肠上皮细胞吸收侧吸收， 通过上皮细胞分泌侧分泌的囊性小泡或外泌体进入血液， 从而到达动物的多个器官［17-18］。

外泌体（exosomes，Exos）是由部分未被溶解酶降解的多囊体与细胞质膜相融合， 使得多囊体中的小囊泡胞吐到细胞外的物质［19-20］。 外泌体可以包被蛋白质、miRNA 和mRNA， 被外泌体包被的miRNA 比游离的miRNA 稳定性更强，用核糖核酸酶处理外泌体，其标志基因CD24 和GAPDH 的表达产物仍能被检测到， 说明外泌体包被可保护miRNA 不受RNase 降解［13，21］。 外泌体的膜成分与其起源的细胞具有一定的同质性，使得外泌体的信号传递具有一定的特异性，在细胞凋亡、肿瘤迁移、病毒扩散、免疫调控等方面都有重要作用［22-26］。 例如母乳中的miRNA 被微泡或外泌体包被，可抵抗核糖核酸酶、冻融循环和低酸碱度（pH=1）。 对牛乳进行巴氏消毒处理前后miRNA 基本保持不变，说明乳中miRNA 仍然具有活性，可参与调节婴儿免疫系统发育［27-29］。 尽管外泌体是生物体内细胞间通信和母婴间通信的工具， 但它们也会被运输到完全陌生的物种体内特别是在人体内， 例如结肠癌细胞（Caco-2）主要通过内吞作用有效吸收牛奶外泌体［30］。这一现象的发现为miRNA 可跨物种调控提供了理论支持。

1.3 miRNA 与靶基因的结合方式

miRNA 主要通过与靶mRNA 结合调控靶基因的表达。 在植物中，miRNA 与mRNA 几乎完全互补配对，miRNA 主要通过5′端的2～8 位碱基与其靶mRNA 互补配对［31］。 当植物miRNA 和目的mRNA 配对不完全时，miRNA 会抑制目的mRNA的翻译，当miRNA 与mRNA 完全互补时，引起目的mRNA 在互补区域内发生特异性断裂， 剪切发生在miRNA 的5′端到3′端第10～11 位核苷酸，mRNA 被降解后失去编码蛋白质的功能， 从而导致基因沉默［32-34］。 在动物中，多数miRNA 以不完全互补方式与其靶mRNA 的3′UTR 区结合，从而阻碍该mRNA 的翻译， 但不影响mRNA 的稳定性［35］。

动物miRNA 主要作用于靶mRNA 的3′UTR区， 从而通过改变靶mRNA 上核糖体密度或特异性降解新合成的多肽链抑制mRNA 的翻译，此外，miRNA 还有可能作用于靶mRNA 的5′UTR 区发挥功能［36］。与动物miRNA 相比，植物miRNA 与靶mRNA 的转录区基本上为完全互补， 其作用方式主要是使靶mRNA 降解从而抑制mRNA 翻译，但也存在例外， 如植物中的miR-172 与其靶序列AP2 mRNA 虽然高度互补， 但引起AP2 蛋白表达受抑，而AP2 mRNA 的水平没有降低［37］。

动植物miRNA 跨物种调控的方式可能存在些许差异， 例如在植物miR-168a 跨界调控动物肝脏LDLRAP1 蛋白的表达中，miR-168a 发挥作用的方式与哺乳动物miRNA 相似， 但miR-168a与LDLRAP1 编码区靶基因序列近乎完全互补，这又显示它的作用方式类似植物miRNA，说明当植物miRNA 可以跨界调控动物时， 结合了动植物miRNA 的作用方式［3］。 动物miRNA 跨物种调控主要是因为动物中的部分miRNA 具有同源性，因此，它们的作用方式主要是动物miRNA 的作用方式， 例如miR-148a 是提高奶牛产奶量的驯化基因， 并且与人类miR-148a 的核苷酸序列完全相同， 允许牛奶和消费者基于miRNA 的跨物种交流［6，38-39］。

2 动植物miRNA 发挥类似的生物学功能

动植物miRNA 均能参与调节细胞生长分化、生物个体发育、组织分化、控制细胞增殖和凋亡、病毒感染、能量代谢、免疫应答、疾病发生发展等。正是由于动植物miRNA 可发挥类似的生物学功能，动植物miRNA 可跨物种调控才成为可能。

2.1 细胞分化

动物中miR-17 和miR-20a 均能有效促进C2C12 成肌细胞和原代牛卫星细胞的分化，miR-18a 可能在C2C12 细胞分化中起负调控作用，而miR-19 和miR-92a 对细胞分化的影响不大［40］；植物miR-172 通过靶向作用APETALA2 类基因参与调控植物开花诱导、花器官形态、果实成熟、叶片和根生长等各器官的发育过程［41］。

2.2 细胞增殖与凋亡

动物miR-138-5p 靶向作用于PD-L-1 抑制乳腺癌细胞的增殖和运动，诱导细胞凋亡［42］。植物miR-319 调控TCP 转录因子参与多种发育途径，包括叶片发育和衰老、器官弯曲、激素合成和信号转导等，其中，TCP4 参与调控细胞增殖，当TCP4活性的小幅增加通过显著减少细胞增殖实现时，对叶片细胞数量有直接影响［43］。

2.3 免疫应答

动物miR-181a 可能通过TLR4 受体通路调节细胞因子的表达， 进而参与抗血吸虫感染的免疫调节［44］； 棉花miR-477 通过靶向作用于GhCPB60A 提高对黄萎病的抗性［45］。

3 动植物miRNA 跨物种后具有组织特异性

植物miRNA 跨物种进入动物体内具有一定的组织特异性，miRNA 通过胃肠道进入动物体后通常存在于组织和体液中， 表达丰度低， 在宿主miRNA 中仅占0.001%［46］。 6 名健康受试者连续食用5～7 d 的素食， 发现粪便中的植物源性miR-168 水平明显升高，在浅层黏膜、结肠黏膜和腹水中检测到植物源性miR-168［47］。 给小鼠饲喂甘蓝后，miR-172 在不同器官中的范围为0.05%～4.50%，在胃肠道、血液、脾脏、肝脏和肾脏中均可检测到，在胃中最高可被吸收4.5%［48］。 给猪饲喂新鲜玉米后， 血清和组织中可检测到玉米miRNA，血清中玉米miRNA 浓度在0.01～0.15 fmol/g，心脏、肝脏、脾脏等组织中的浓度为0.001～0.500 fmol/g［49］。 灌喂人工合成玉米miR-164a-5p、miR-167e-5p 和miR-168a-3p 24 h 后， 猪组织中3 种玉米miRNA 浓度在0.05～0.80 fmol/g；各组织间玉米miRNA 含量存在差异，miR-164a-5p 在眼肌中含量最高（0.21 fmol/g），在肺脏中最低（0.11 fmol/g），miR-167e-5p 在心脏中浓度最高 （0.79 fmol/g），在背部皮下脂肪中最低（0.16 fmol/g）［50］。 这一现象的发生可能是由于植物囊泡上的糖蛋白与微囊泡细胞的表面相容性差［51］。

人饮用牛奶后血液中牛乳外泌体含量升高，表明通过肠道上皮细胞可100%运输牛乳成分，并在血液中停留长达9 h，在肝脏和脾脏等器官停留长达24～48 h［30］。 牛乳外泌体中的miRNA 可以进入人类的循环系统［52］。 在小鼠模型中的时间进程分析表明，在摄入后3 h，外泌体miRNA 仍分布在肝脏、脾脏、心脏和肺中［53］。 以上研究表明植物miRNA 跨物种进入动物体内的组织特异性更高，而动物miRNA 组织特异性不是很明显，但存在时间较长，两者都可稳定存在。

4 动植物miRNA 跨物种调控的研究进展

早期研究发现，细胞可分泌miRNA 并进入受体细胞进行基因表达调控这一 “跨界调控”［2］，后期研究发现食源性miRNA 可靶向作用于动物mRNA 从而发挥重要作用。

4.1 植物源性miRNA 跨物种调控

植物miRNA 跨物种调控目前已有很多报道，例如中草药、西蓝花、大豆、苜蓿、辣木等植物中的miRNA 均有跨物种调控的作用，主要涉及对癌症以及病毒的调控。

中草药洪景天中的HJT-sRNA-m7 可与该草药煎液中的油溶性化学物质形成复合脂质体，促进HJT-sRNA-m7 在细胞中的摄取， 中药煎液中的衍生物可能会与sRNA 形成脂质体复合物，从而进入肺泡和胃细胞， 有效减少纤维化标志基因和蛋白在体外肺泡细胞和体内小鼠肺组织的表达［54］。 有研究发现，金银花中的miR-2911 可以抑制SARS-CoV-2 病毒复制， 加速感染者的阴性转化； 首先在细胞层面使miR-2911 过表达，用SARS-CoV-2 感染细胞24 h 后，定量分析发现，与对照组相比miR-2911 抑制了93%的病毒复制，说明金银花汤中的miR-2911 可以抑制SARSCoV-2 病毒的复制；随后评估了金银花汤中miR-2911 对新冠肺炎患者阴性转化率的影响， 将75例中度新冠肺炎患者分为两组， 一组为金银花汤组 （miR-2911+）， 另一组为传统的中药治疗组（miR-2911-），miR-2911+组的7 d 阴性转化率为83.3%；说明金银花汤中的植物miR-2911 可以抑制SARS-CoV-2 病毒复制并加速感染者的阴性转化，并且有极大可能帮助治疗感染，阻止新冠肺炎大流行［55-57］。 辣木植物中的miRNA 可诱导减少细胞内HIV p24 蛋白和病毒DNA 整合，降低病毒的感染率［58］。

西蓝花中高表达的miR-156a 能结合至JAM-A 蛋白的3′UTR 区抑制鼻咽癌细胞株上皮间充质转化［59］；苜蓿miR-5754 和大豆miR-4995通过靶向作用于肿瘤相关的长非编码RNA 转移相关的基因MALAT1 和NET 1 减少癌细胞的产生［60］；植物miR-159 的合成模拟物能够通过靶向编码Wnt 信号转录因子的TCF7 抑制哺乳动物癌细胞增殖［61］； 植物源性miR-156a 通过靶向作用Wnt/β-catenin 通路中Wnt10b 抑制哺乳动物肠上皮细胞的增殖［62］； 此外， 还发现植物源性miR-167e-5p 通过下调β-连环蛋白的基因和蛋白水平抑制哺乳动物肠上皮细胞增殖［63］。 这些现象都表明植物miRNA 可跨物种调控，为后期治疗疾病或提高免疫力提供新的思路。

此外，有研究发现植物miRNA 还可以通过母体传递给胎儿。 通过qPCR 在小鼠胎儿中也发现了植物miRNA，说明miRNA 可能通过胎盘转移至胎儿［64］。研究者对金银花miR-2911 和流感病毒的成熟miRNA 进行追踪， 结果发现母体血浆中miRNA 均显著增加，在胎儿中也显著升高，说明miRNA 可以通过胎盘转移至胎儿，可为胎儿健康发育和治疗母体子宫疾病提供一种新的研究策略［64］。 熊猫乳汁外泌体中存在竹子源性miRNA，并且通过靶基因富集分析发现表达量排名前十位的外源性miRNA 主要参与基本的细胞代谢和神经发育，表明外源性miRNA 在大熊猫幼仔出生后的发育过程中发挥潜在作用［65］。 给妊娠90 d 的经产金华母猪饲喂玉米后，在母猪血清、肝脏和胎儿肝脏、 脾脏等组织中均能检测到玉米miRNA，说明母猪采食玉米后玉米miRNA 可传递给胎儿［13］；在泌乳期母猪的乳汁外泌体中也检测到了植物miRNA［66］。

4.2 动物源性miRNA 跨物种调控

动物miRNA 跨物种调控主要是人通过采食动物性产品例如牛奶和鸡蛋， 参与调控以及在一种动物体内发现另一种动物的miRNA 调控。

乳汁中的miRNA 主要通过外泌体进入人体，并进入循环系统发挥作用。 例如母乳中的miR-223 可靶向作用T 细胞和粒细胞群对婴儿免疫系统产生作用［52，67］；妊娠期间大量摄入牛乳中的必需支链氨基酸和miR-21 会使得胎盘和胎儿过度生长［68］； 鸡蛋携带的miRNA 可进入人的外周组织，影响外周血单核细胞中的基因表达［5，51］。 猪乳外泌体miRNA 通过抑制小鼠肠上皮细胞中的TLR4/NF-κB 和p53 通路减弱LPS 诱导的细胞凋亡，从而保护肠上皮细胞免受LPS 诱导的损伤［69］；水牛的牛奶外泌体衍生的miRNA 与免疫反应和代谢过程有关［70］。

5 展望

通过以上论述发现，动植物miRNA 由于自身的特殊结构或外泌体的包被， 被动物吸收进入摄食者体内仍具有一定的稳定性和组织特异性，且可跨物种调控摄食者的靶基因表达和生理功能。植物中的小分子物质对于摄食者是否都发挥正向调控作用或展现出积极的一面， 目前尚未完全阐明，因此，需要更多的研究验证。 目前已有研究表明在服用中草药后可提高机体抵抗力或治愈疾病， 这一作用机制可从植物跨界调控这方面的研究进行阐述，但在动植物跨界过程中，摄食者的个体差异对于跨物种调控的影响有多大， 目前的研究还较少，需要更多深入的研究进行阐明。动植物miRNA 可跨界调控的研究有重要意义： 一方面，在植物分子育种中通过选育特定高表达植物miRNA 的新品系或新品种，可充分利用自然界丰富的遗传资源， 使遗传物质在植物和动物之间进行交流，为植物分子育种提供新思路和新方向；另一方面，动植物miRNA 可在摄食者体内稳定存在并发挥作用，提取这些特殊的miRNA 或人工合成miRNA 可用于治疗疾病和补充营养，改善动物生产性能，其应用潜力和价值值得深入探讨。 为此，对动植物miRNA 的调控功能进行更全面深入地了解， 将对疾病治疗和提升动物生产性能有重要作用。