微生物肥料与化肥减量配施对多年生黑麦草生长的影响

撖冬荣，姚拓*，李海云，黄书超，杨琰珊，高亚敏，李昌宁，张银翠

（1. 甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070；2. 甘肃农业大学草业生态系统教育部重点实验室，甘肃 兰州 730070；3. 甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州 730070）

我国是化肥使用大国，施用化肥是保障植物高产优质的重要措施［1］，但不合理施用化肥并不能带来持续增产，相反会造成资源浪费，生态环境破坏、土壤质量降低等一系列问题［2］。近年来，针对此类问题，国家制定了《到2020 年化肥使用量零增长行动方案》以及2019 年中央一号文件中强调的“加大农业方面源污染治理力度［3］，开展农业节肥节药行动，实现化肥农药使用量负增长［4］”等相关政策。因此，利用有益微生物制作的菌剂来减少农业生产上的化肥施用量［5］，是实现化肥减量的重要措施，由此对微生物肥料的研究与应用逐渐成为社会关注的热点［6］。

多年生黑麦草（Lolium perenne）属于禾本科黑麦草属，是营养价值较高的牧草之一，同时被广泛用于我国北方城市绿地及运动场草坪草建植［7］，其分蘖能力和适应性强。有研究发现：在12 种多年生牧草品种引种适应性比较中，多年生黑麦草适应性较好，同等条件下其适应性高于白三叶（Trifolium repens）、红三叶（Trifolium pratense）及紫花苜蓿（Medicago sativa）［8］；目前，为提高多年生黑麦草产量及营养品质等，研究学者在种植方式，品种及施肥方面研究较多，但从改良土壤质量、提高肥料利用率，进而达到高产优质的研究较少。为此，微生物肥料因具有促进牧草对养分的吸收、提高土壤肥力和改良土壤质量等优点成为实现化肥减量、保护生态环境的重要途径。但是，大量研究表明，微生物肥料不能完全取代化肥，需合理搭配化肥施用。

鉴于此，本研究以多年生黑麦草为研究对象，设置化肥减量配施不同剂量微生物肥料，测定多年生黑麦草农艺性状、根系形态、营养品质和抗氧化酶活性，筛选微生物肥料与化学肥料最佳配比，以期为多年生黑麦草制定最优施肥方案、研发多年生黑麦草专用微生物肥料，在维持多年生黑麦草正常生长和发挥生态功能的基础上，实现降低化肥施用量，减少环境污染和石化能源的消耗。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 P2：普罗威登斯菌（Providencia rettgeri）；P4：克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）；P19：醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）；P35：腐败沙雷菌（Serratia plymuthica）。供试菌株由本课题组提供，具体菌株促生特性信息见表1［9］。

表1 植物根际促生菌菌株的促生长特性Table 1 Growth promoting characteristics of plant growth promoting rhizobacteria（PGPR）strains

1.1.2 供试牧草 多年生黑麦草种子购自甘肃省农业科学院种子市场。

1.1.3 微生物肥料 1）菌悬液制作：将菌株P2、P4、P19、P35 分别单接种于无菌LB（luria-bertani）液体培养基，置于摇床培养2～3 d（180 r·min-1，28 ℃），各菌液含菌量达108cfu·mL-1时，将菌液等比例混合，备用［10］。2）微生物肥料制作：将木炭、草炭和粉碎的玉米（Zea mays）秸秆3 种载体等比例混合，间接性灭菌（121 ℃，26 min）两次，将灭菌完的载体放入超净工作台降至室温后取1 kg 装入聚乙烯袋中，加适量无菌水再加混合菌液80 mL，封口并用无菌针扎小孔，以便透气，并置于28 ℃培养箱培养7～10 d。

1.1.4 化学肥料 产自湖北新洋丰肥业股份有限公司，养分含量≥45%（N∶P2O5∶K2O=14∶16∶15）。

1.2 试验设计

试验于2019 年7 月在智能生长室进行，模拟室外生长条件，白天：光照16 h，湿度45%，温度23 ℃；夜晚：黑暗8 h，湿度45%，温度19 ℃。准确称取1.2 kg土壤于花盆中，花盆规格（上口直径15 cm，底面直径12 cm，高13.5 cm）。选取20 粒大小一致且颗粒饱满的多年生黑麦草种子进行消毒，将种子与微生物肥料和化肥拌种，均匀种植于花盆中，种子出苗后，定量浇水，每盆留15 株长势均一健康的多年生黑麦草。试验共设11 个处理，每个处理4 次重复，具体设置见表2。

表2 试验处理详情Table 2 Test treatment details

1.3 测定方法

1.3.1 农艺性状测定 每个花盆随机选取10 株进行农艺性状测定：采用直尺法［11］测定株高（自然高度）；采用游标卡尺法［11］测定茎粗（相同位置）；采用烘干法［11］测定生物量。

1.3.2 根系形态 采用LA2400 scanner（Epson Expression 1000 XL，北京）型根系扫描仪测定根系形态相关指标［12］。

1.3.3 营养品质测定 采用凯氏定氮法［13］测定粗蛋白（crude protein，CP）含量；采用粗脂肪测定仪（SZC-D，杭州）［14］测定粗脂肪（ether extract，EE）含量；采用Van Soets 法［15］测定酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）和中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）含量。计算公式：ADF（NDF）（%）=（m2-m1）/m×100%［15］（m为试样质量，m1为滤网袋质量，m2为ADF 或NDF 和滤网袋质量）。

1.3.4 抗氧化酶活性和丙二醛含量测定 采用愈创木酚法测定过氧化物酶（peroxydase，POD）活性［16］，POD（U·g-1FW）=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）［16］，ΔA470为反应时间内吸光度的变化，W为样品鲜重（g），t为反应时间（min），Vt为提取酶液总体积（mL），Vs为测定时取用酶液体积（mL）。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法测定［16］，SOD（U·g-1FW）＝［（Ack-AE）×V］/（1/2Ack×W×Vt）［16］，Ack为对照管的吸光度，AE为样品管的吸光度，V为样品液总体积（mL），Vt为测定时的酶液用量（mL），W为样品鲜重（g）。抗坏血酸过氧化物酶（aseorbate peroxidase，APX）活性采用过氧化氢比色法测定［16］，APX（U·g-1FW）=ΔA290×VT/（0.01Vs×t×W）［16］，ΔA290为反应时间内吸光度的变化，VT为提取液总体积（mL），Vs为酶液的体积（mL），W为叶片的鲜重（g），t为反应时间（min）。丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量采 用 硫 代 巴 比 妥 酸 法 测 定［16］，C（μmol·L-1）=6.45（A532-A600）-0.56A450［16］，MDA（μmol·g-1FW）=C×V/W［16］，V为提取液体积（mL），W为样品鲜重（g）。C 为MDA 浓度，A532、A600、A450分别代表532、600、450 nm 处的吸光值。

1.4 数据处理

采用SPSS 24.0 对试验数据进行Duncan 新复极差法差异显著性检验和主成分分析，用Excel 2010 制作图表。

2 结果与分析

2.1 微生物肥料与化肥减量配施对多年生黑麦草农艺性状的影响

B2株高最高（表3），较CK 提高12.35%。B3茎粗提高最大，较CK 提高29.41%，其次为C5和B2，分别较CK 提高8.40%和5.88%。B3、B4和C4处理下，地上生物量较CK 分别提高16.84%、6.86%和11.04%；80%CF 配施120 kg·hm-2MF，地下生物量较CK 增加最多。

表3 多年生黑麦草农艺性状特征变化Table 3 Changes in agronomic characteristics of perennial ryegrass

2.2 微生物肥料与化肥减量配施对多年生黑麦草根系形态的影响

B3处理下，总根长、总根表面积、总根体积和根尖数增加最多（表4），分别较CK 提高21.15%、14.59%、166.67%和47.35%；B2处理分枝数最多，较CK 提高60.40%；B1处理交叉数最多，较CK 提高85.10%。

表4 多年生黑麦草根系形态特征变化Table 4 Changes in root morphological characteristics of perennial ryegrass

2.3 微生物肥料与化肥减量配施对多年生黑麦草营养品质的影响

化肥减量配施微生物肥料，粗蛋白含量显著升高（表5），其中较CK 提高10%以上的为处理B4、B5、C4，分别提高14.71%、20.92%和10.01%，差异显著（P＜0.05）。B3处理下，粗脂肪含量提高最多（P＜0.05），较CK 提高37.98%。80%CF 配施60，120 和150 kg·hm-2MF，ADF 含量较CK 增加，其余各处理ADF 含量均低于对照，60%CF 配施150 kg·hm-2MF，ADF 含量最低，较CK 降低16.11%；各处理水平下NDF 含量较CK 均降低，C2处理NDF 含量最小，较CK 降低28.03%。

表5 多年生黑麦草营养品质变化规律Table 5 Changes in nutritional quality of perennial ryegrass

2.4 微生物肥料与化肥减量配施对多年生黑麦草抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响

APX 活性在不同处理间差异不显著（P＞0.05），其活性为0.019～0.035 U·g-1FW（图1）。B1处理MDA 含量最低，较CK 降低19.29%，其次为B2处理，较CK 降低15.22%。80%CF 配施不同剂量微生物肥料，POD 活性随微生物肥料增加，呈下降趋势，差异显著（P＜0.05），C2处理下降最多，较CK 下降43.41%。B3处理SOD 活性下降最多，较CK 下降10.66%，差异显著（P＜0.05）。

图1 多年生黑麦草抗氧化酶活性和丙二醛含量变化特征Fig.1 The change characteristics of antioxidant enzyme activity and malonaldehyde content of perennial ryegrass

3 讨论

3.1 微生物肥料与化肥减量配施对多年生黑麦草农艺性状的影响

株高、茎粗、生物量是衡量牧草生长发育状况的重要指标，可作为描述牧草生长状况及产量的直观表象［16］。研究结果表明，当化肥减量20%（240 kg·hm-2）配施90 kg·hm-2微生物肥料，多年生黑麦草株高最高，较CK 增长12.35%；当化肥减量20%（240 kg·hm-2）配施120 kg·hm-2微生物肥料，多年生黑麦草茎粗、地上生物量和地下生物量均最高，较CK 分别提高29.41%、16.84%和45.54%，郭艳娥等［17］研究发现内生真菌增加了黑麦草的生物量和养分含量，本研究结果与此一致；研究还发现化肥减量20%配施5 种剂量微生物肥料，株高、茎粗、地上生物量和地下生物量均随微生物肥料剂量增大呈先上升后下降的趋势。纪开萍等［18］在小粒咖啡（Coffea arabica）苗接种暗褐网柄牛肝菌纯培养菌种后，小粒咖啡苗（树）的根茎、主根及侧根被茶褐色的菌索和菌膜包裹，因此出现该变化规律的原因可能是大剂量微生物肥料会在植物根系形成一层菌膜，抑制根系对营养物质的吸收，进而影响植株生长发育。

3.2 微生物肥料与化肥减量配施对多年生黑麦草根系形态的影响

根系是土壤养分的利用者和产量的贡献者［19］，对植株起固定作用，同时根系是作物吸收水分和营养物质的主要通道，以供植物体正常生长发育［20］。本研究结果发现，化肥减量20%（240 kg·hm-2），多年生黑麦草总根长、总根表面积和总根体积普遍高于化肥减量40%（180 kg·hm-2）。其中，B2处理下，总根长、总根表面积和总根体积分别较CK（全量化肥）提高21.15%、14.59%、166.67%。陈香碧等［21］研究发现，在干湿交替的稻田土壤中，化肥减量使水稻（Oryza sativa）根长密度、根重密度、根表面积、根活性吸收面积和根系氧化能力比全化肥处理大幅度增加（约40%），有利于水稻良好根系形态的形成，本研究结果与此一致。

3.3 微生物肥料与化肥减量配施对多年生黑麦草营养品质的影响

粗蛋白、粗脂肪、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维是牧草重要的营养指标。Yanni 等［22］从水稻根际分离出联合固氮细菌（nitrogen fixing bacteria）并接种于水稻，发现水稻CP 含量显著增加，同时籽粒重量、籽粒粗蛋白含量和水稻收获指数也增加。马军妮等［23］研究发现施加微生物肥料可显著促进玉米籽粒灌浆速度，在灌浆期，菌剂处理玉米百粒鲜重、百粒干重及单穗籽粒重较对照分别增加32.3%、83.9%及99.1%，籽粒含水量降低36.9%。本研究结果表明，微生物肥料对多年生黑麦草营养品质的积累具有促进作用，化肥减量20%配施5 种不同剂量微生物肥料，CP 含量随微生物肥料剂量的增加呈逐渐上升趋势，EE 含量在B3处理达最大值，化肥减量40%，ADF 和NDF 含量最低，该变化趋势与牧草农艺性状变化趋势不一致。一方面是因为：该试验中发现，化肥减量20%配施90 和120 kg·hm-2微生物肥料，牧草生育期会提前7 d 左右，出现此变化规律是由于牧草营养品质会随生育期而变化，李菲菲等［24］研究发现，牧草营养品质随牧草生育期呈先上升后降低趋势，本研究中出现农艺性状与营养品质变化不一致现象与该研究结果一致，此发现在后续试验中需进行深入研究，以探索微生物肥料对牧草生育期的影响，筛选牧草最佳收获期。另一方面：微生物肥料中所含的根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）在土壤及植物根际的定殖情况及存活率受时间、气候、土壤微环境等多种因素影响，因此随时间变化，微生物存活率逐渐降低，以致微生物肥料肥效降低或失效。

3.4 微生物肥料与化肥减量配施对多年生黑麦草抗氧化酶活性的影响

抗氧化酶活性在植物应答逆境胁迫过程中具有重要作用［25］。本研究结果发现，化肥减量20%，牧草叶片中MDA 含量先下降后上升；化肥减量20%和40%，POD 活性均低于对照，可能大剂量化肥对牧草有胁迫作用，打破了植物体内活性氧平衡［26］，POD 活性增大以消除胁迫；各处理水平下，SOD 活性变化规律性不强，APX 活性总体差异不显著，原因可能是牧草的生长需要由多个生理过程协作完成，单一指标的高低只能反映某一方面，无法准确地反映其真实抗性强弱［27］。因此，需要综合牧草多项生理指标进行评价，客观全面地描述其真实抗性能力。

4 结论

1）全量化肥（300 kg·hm-2）和80%化肥（240 kg·hm-2）配施大剂量微生物肥料（＞150 kg·hm-2）对多年生黑麦草有胁迫作用。2）通过综合评价结果表明，80%化肥（240 kg·hm-2）配施90～120 kg·hm-2微生物肥料，对促进多年生黑麦草生长和营养品质的积累效果显著，是最佳肥料量配比。