厨余垃圾生物合成聚羟基脂肪酸酯研究进展

李京霖，郑 义，赵丽雅，王 攀*，杨鑫玉，任连海**

（1.中国中元国际工程有限公司，北京 100089；2.北京工商大学生态环境学院，北京 100048）

0 前言

据统计，约93%的废弃塑料最终会通过填埋或焚烧的方式进行处理。石化塑料由于自身结构复杂，对填埋场周边土壤及水体存在持久性污染，且在焚烧的过程中可以产生自身3倍质量的CO2［1］。因此，有必要生产一种性质优异且具有可持续发展前景的塑料来替代石化塑料［2］。聚羟基脂肪酸酯（PHA）被认为是一种“生物可降解塑料”，其降解速率是传统石化塑料的50～100倍；降解后最终产物为水和CO2，可进入自然界实现碳循环，已经被用来作为石油基塑料的替代产品［1］。此外，PHA材料还具有许多和聚丙烯塑料类似的性质，广泛应用于包括工业、医疗药物、农业、养殖业及环境在内的各种领域；具体应用总结于表1中。

表1 PHA在不同领域的应用Tab.1 Application of PHA in different fields

PHA是由细菌合成并以颗粒形式储存在细胞内的生物聚酯，到目前为止，已经发现了超过150种不同的PHA结构。根据碳单体数量不同，可将PHA分为短链、中链和长链［11］：短链PHA（SCL）单体由3～5个碳原子组成，具有结晶度高、材质强硬等特性，常见的有聚羟基丁酸酯（PHB）和聚羟基戊酸酯（PHV）；中链PHA（MCL）单体由6～14个碳原子组成，具有结晶度较低、材质柔软坚韧等特性，常见的有聚羟基己酸酯（PHHx）和聚羟基辛酸酯（PHO）；长链PHA（LCLs）单体由大于14个碳原子组成。

根据单体聚合方式的不同，可以将PHA分成同聚物和共聚物［12］：同聚物指的是只含有一种单体的PHA聚合物，例如PHB；共聚物是指由两种或两种以上的PHA单体聚合而成的聚合物，例如3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯共聚物（PHBV）［13］。PHB 是最常见的PHA材料，具有与聚丙烯类似的热塑性，但由于韧性和热稳定性较差而无法广泛应用于塑料生产中。PHBV作为羟基丁酸酯（HB）和羟基戊酸酯（HV）的共聚物，因具有更高的强度、硬度、弹性、韧度、抗冲击性和加工特性而被广泛研究［14］。

目前，微生物法合成PHA工艺由于底物成本高，存在技术应用瓶颈［15］。以往的研究大多是利用葡萄糖、油类、纯酸作为合成PHA的碳源［16］，生产成本高达到每千克2～8美元；利用纯菌合成PHA成本更是高达16美元［17］。碳源成本约占整个生产过程的40%～50%；并且仅利用碳水化合物为碳源，很难在天然条件下合成出PHB外的其他类型PHA，需要在微生物中重新构建基因组合成途径，或进行二次共聚［17］。利用有机质废弃物发酵产生的挥发性脂肪酸（VFAs）作为微生物合成PHA的碳源，不仅可以降低生产成本，还可以达到有机质废弃物的资源化利用。目前，已经对各种廉价碳源进行研究，例如木质纤维素（甘蔗渣、稻草、麦麸）、食品工业废弃物（乳清、咖啡渣、糖类、酒糟）、脂质（植物油、动物脂肪、）及污水污泥［10-11，18］。

在之前的研究中利用活性污泥生成VFAs作为PHA合成的前体物被多次报道［19］，但与活性污泥相比，厨余垃圾中的有机质含量更为丰富，水解酸化效率也更高，更适合作为合成PHA前体物的原始底物。厨余垃圾包含多种有机物质，如碳水化合物、蛋白质、脂质和纤维素，可用于生产廉价碳源（VFAs）［20］，进而可以作为微生物合成PHA的碳源［21］。

本文重点关注利用厨余垃圾作为低成本碳源合成PHA的工艺方法及代谢机制。探究合成PHA前体物合成过程以及PHA合成过程中的影响因素，并分析其对合成PHA前体物及合成PHA的影响，提高PHA产量，优化PHA合成的类型。

1 厨余垃圾产PHA工艺及代谢机制

1.1 工艺流程

利用厨余垃圾作为碳源合成PHA主要采用3段式工艺，如图1所示：（1）PHA前体物合成；（2）混合菌群富集或纯菌培养；（3）微生物体内合成PHA。

图1 利用厨余垃圾产PHA工艺流程Fig.1 Technological process of PHA production by kitchen waste

1.1.1 PHA前体物合成

厌氧酸化过程是传统厌氧发酵产甲烷过程的初始阶段，反应中以水解细菌和酸化细菌为主导微生物进行一系列偶联的生物化学反应，合成高利用价值的VFAs［22］。在厨余垃圾合成PHA工艺中，利用厨余垃圾为有机质底物在厌氧条件下通过水解、产酸步骤转化为以乙酸、丙酸为主的VFAs作为后续合成PHA过程的微生物碳源。

1.1.2 混合菌群富集或纯菌培养

（1）活性污泥混合菌群驯化：利用好氧瞬时供料方法（ADF）驯化活性污泥，通过控制SBR反应器中碳源的供应量，使微生物反复处于“丰盈”和“饥饿”的状态，达到增强微生物体内合成PHA能力的目的。在“丰盈”状态下，菌群可以将过剩碳源转化成PHA储存在体内；而在“饥饿”状态时，已经合成PHA的微生物可以利用PHA作为生长和代谢所需碳源，不能合成PHA微生物的生长代谢受到抑制，从而在活性污泥中富集合成PHA菌群［23］。其中，微生物驯化中控制系统丰盈和饥饿时长已被广泛认为是驯化成功的关键因素，其中丰盈时长小于全周期的25%［24-25］。在ADF的基础上，根据微生物“沉降性”差异，提出了好氧动态排水方法（ADD），合成PHA后的菌群细胞质量高于其他菌群，沉降性会增强，从而淘汰掉部分合成PHA能力弱的菌株，实现对PHA 合成菌群的富集［15，26］。

（2）纯菌株筛选和培养：通过配置不同的筛选培养基和发酵培养基，选择可以利用VFAs为碳源合成PHA的高转化率菌株。目前，已有研究发现了如Ralstonia eutropha和Pseudomonas putida等诸多工业化菌种，可利用脂肪酸合成PHA以降低合成成本［8］。

1.1.3 PHA合成

在已驯化的混合菌群或富集培养的纯菌体系中加入厨余垃圾水解酸化产生的VFAs，通过控制适宜的培养条件，实现 PHA 在微生物细胞内的大量合成［18，27］。目前，已有的PHA合成技术按照合成方式主要分为序批式、补料序批式和连续式［28］。序批式操作简单、常适用于探究合成过程影响因素或最优参数；但由于其在反应开始后不能持续加入反应物，微生物在合成PHA过程末期中存在“饥饿”现象，会导致PHA积累不完全或已合成的PHA被微生物作为碳源利用，使合成量降低［15］。补料序批式可以通过在反应过程中添加微生物所需营养弥补序批式的问题；但由于持续增加投料，其最初设计和反应器制作具有难度，虽然目前应用较为广泛，但不易于大规模生产PHA［29］。连续式反应是众多技术应用的必要方法，也是合成PHA工业化的必经之路；连续式合成PHA在工艺设计和操作上更加简单，也可以完全弥补反应器内营养不足的劣势，使微生物丰度在合成PHA过程中处于稳定状态［28］。关于利用厨余垃圾水解酸化液连续式合成PHA的研究还不广泛，但利用生产酵母废水为碳源连续式合成PHA已有研究，且合成效果显著，理论产量可高达270 t/a［30］。Tan等［31］也利用分段连续式方法进行了PHA合成实验，碳源转化率达到50%以上。

1.2 合成机制

1.2.1 VFAs合成机制

如图2所示，VFAs的合成机制主要分为两个阶段：水解和酸化。在第一阶段水解过程中，厨余垃圾中主要的大分子有机质（碳水化合物、纤维素、蛋白质、淀粉、脂质）通过微生物分泌的胞外水解酶（纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等）水解为单糖、氨基酸、长链脂肪酸和甘油等可溶性有机物。在第二阶段产酸过程中，产酸微生物利用可溶性小分子有机物等水解产物合成VFAs（乙酸、丙酸、丁酸、戊酸）为主的有机酸和少量乙醇，其中主要反应过程化学方程式见表2。此外，发酵产酸后的产物在产氢产乙酸菌和同型产乙酸菌的作用下继续转化，生成乙酸、H2和CO2。

表2 提升VFAs产量的预处理条件Tab.2 Pretreatments to increase VFAs production

图2 厨余垃圾厌氧产酸机理Fig.2 Mechanism of kitchen waste anaerobic acidification

表2 产酸化学反应过程Tab.2 Chemical reaction process of acid production

1.2.2 PHA合成机制

PHB、PHV和PHBV作为利用VFAs主要可合成的生物可降解塑料，其合成机制如图3所示。

图3 PHA合成机理Fig.3 Mechanism of producing PHA

（1）PHB合成途径：在乙酰辅酶A合成酶（acs）作用下，VFAs中的乙酸转化为乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）。两个乙酰辅酶A分子在β-酮硫解酶（PhaA）的催化下缩合为乙酰乙酰辅酶A（Acetoacetyl-CoA）；而后被依赖NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶（PhaB）还原为3-羟基丁酰基辅酶A［（R）-3-hydroxybutanoyl-CoA］。最终在PHA聚合酶（PhaC）的作用下聚合为PHB。

（2）PHV、PHBV合成途径：在丙酰辅酶A合成酶（PrpE）作用下，VFAs中的丙酸转化为丙酰辅酶A（Propionyl-CoA）。乙酰辅酶A和丙酰辅酶A在β-酮硫解酶（PhaA）催化下缩合为3-酮戊酰辅酶A（Ketovaleryl-CoA），而后在NADPH充足的条件下，通过乙酰乙酰辅酶A还原酶（PhaB）催化生成3-羟基戊酰辅酶A［（R）-3-hydroxyvaleryl-CoA］。最终在PHA聚合酶（PhaC）作用下合成PHV。此外，3-羟基丁酰基辅酶A和3-羟基戊酰辅酶A共同在PHA聚合酶（PhaC）作用下可合成PHBV共聚物。

2 影响PHA前体物合成的因素

2.1 预处理对合成VFAs的影响

厌氧酸化过程中，VFAs的合成效率一般受到固态有机物水解速率低和产甲烷菌对VFAs的快速消耗的双重限制，其中有机质水解被认为是主要限速步骤；因此在厌氧消化前增设预处理工艺，可以提高有机物厌氧消化合成VFAs的产量［21］。目前，厌氧发酵预处理的方法较为广泛，包括物理预处理、化学预处理和生物预处理［32］，一些常见的厨余垃圾预处理技术及其特点在表3中进行了展示。

其中热预处理和酸碱预处理法在加快有机质水解和去除产甲烷菌方面均有促进作用［33］。Yin等［34］和Liu等［35］均研究了热预处理温度对厨余垃圾产酸的影响，发现150～180℃热预处理后合成VFAs的产量最高，且厌氧消化过程中SCOD、可溶性蛋白质和可溶性碳水化合物的浓度明显提高，有利于提升厨余垃圾水解效率。Zou等［36］进一步对热预处理和碱性处理的操作顺序进行探索，发现先碱后热预处理对有机质溶解度的提升高于同时热碱法和先热后碱法；这表明热预处理可以和酸碱预处理进行协同作用，可提升厨余垃圾中有机质厌氧水解效率。

2.2 pH值对合成VFAs的影响

在厌氧发酵产酸系统中，VFAs产量及组成受pH值影响显著；不同pH值反应条件可以影响系统中的微生物群落结构，进而影响VFAs的产量以及组成。此前对厌氧产酸最佳pH值的研究主要分为控制厌氧过程为恒定pH值和优化初始pH值。

近年来，一些学者研究了利用厨余垃圾为底物时厌氧产酸系统恒定的pH值对合成VFAs产量的影响。Jiang等［48］和Wang等［49］均发现控制厨余垃圾厌氧产酸过程中pH值恒定为6对VFAs合成量提升最明显，产酸类型主要为乙酸和丁酸。此外，反应pH值为6时，固态有机质利用率达到峰值，并推测pH=6是水解酶活性最佳的条件。

另一些学者研究发现调控厨余垃圾厌氧产酸过程的不同初始pH值对合成VFAs有明显影响。Khatami等［50］和Dahiya等［51］发现初始pH值为碱性更有利于厨余垃圾合成VFAs，其中乙酸含量提升也尤为明显；在初始pH=10的条件下进行厌氧产酸，产量高于pH值为5～9条件时，更是达到pH=5条件时的1.7倍以上。大部分学者通常把初始产酸条件调整为碱性；是因为在反应进行后pH值会随着体系酸化而逐渐中和，进而在中性和弱酸性条件下，达到最高的VFAs产量。相比于持续弱酸性条件，反应初期的碱性pH值还会消除厌氧体系部分产甲烷菌，进而减少合成的VFAs被消耗，具有一定的优势。

2.3 温度对合成VFAs的影响

温度也是微生物生长和VFAs合成的重要决定因素，每一类微生物都有最适宜富集的温度范围。温度不仅影响产酸效率，还影响发酵过程中VFAs的组成，因此厌氧发酵产酸的适宜温度需要被着重研究。

赵宋敏等［52］和 Jiang 等［20］均发现厨余垃圾合成VFAs在中温条件下［（37±2）℃］产量要高于高温和低温条件，并发现低温会影响反应体系中水解菌的活性。这与Jiang等［48］发现在35和45℃条件下VFAs产量类似，高温使厨余垃圾中有机物水解效率增加，但并没有提升合成VFAs的效率的结论一致。通过各研究对于厨余垃圾厌氧产酸温度的汇总可以确认，中温条件是厌氧产酸的最佳温度。

2.4 有机负荷率（OLR）对合成VFAs的影响

底物负荷也会在厌氧产酸过程中产生影响，Hong等［53］和李龚［54］均发现 OLR 在 8～10 g VS/（L·d）的范围下最有利于VFAs中乙酸、丙酸和丁酸合成；但过度增加厌氧系统OLR会造成反应器运行不稳定，会导致VFAs产量下降。Jiang等［48］进一步发现过高的OLR导致已合成的VFAs快速分解，并得出结论OLR为11 g TS/（L·d）最适于VFAs合成。上述几位学者得出的影响趋势相似，但最适条件略有差异，这可能是由于不同研究中利用VS、TS等衡量有机质方式的不同引起了最佳参数的波动。

2.5 碳氮比（C/N）对合成VFAs的影响

调整初始碳氮比可以影响微生物自身的合成代谢过程以及有机物在微生物体内的生物氧化过程，同时也可以诱使不同产酸功能菌群在厌氧体系中的富集，从而调控不同产酸类型［55］。已有研究发现随着C/N从12升高至156，产酸发酵类型由乙酸型转变为丙酸型，最终转变为丁酸型［56］。李灿等［57］认为 C/N=37时，VFAs产量及转化率达到最大值；并且发现调高C/N可以缓解乙酸在反应后期分解，使其含量稳定保持在80%以上。初始碳氮比的调整对厌氧发酵系统的效率有非常大的影响［58］，但初始C/N对于利用厨余垃圾合成VFAs影响的研究相对较少，C/N对于VFAs产量并没有得出明确的影响规律，需要进一步被探索。

3 影响合成PHA的因素

3.1 碳源对合成PHA的影响

众多学者对VFAs类型对PHA合成的影响进行了深入研究，Reddy等［59］分别利用污泥和餐厨垃圾的水解酸化液作为碳源探究合成HB和HV的含量；发现利用污泥发酵液合成的HB含量超过90%；但利用餐厨垃圾发酵液则可以合成35%的HV含量，并归因于是两种发酵液中VFAs成分的区别。Kourmentza等［60］发现乙酸和丁酸合成均聚物PHB，而在丙酸存在时的可合成66%的HV，进而生成物共聚为PHBV；且丁酸合成PHA的效率高于乙酸和丙酸，因为利用丁酸合成PHA的过程不需要NADPH的作用。Hao等［61］也发现在合成PHA过程中，微生物可以优先利用戊酸产生HV，其次再对乙酸和丙酸进行利用；这表明丁酸和戊酸的合成效率高于乙酸和丙酸。

但Jiang等［62］在混合碳源合成PHA过程中发现微生物主要通过吸收乙酸来进行自身生长，增加微生物体内PHA类物质的储存能力，获得较高的PHA产量。因此，微生物对VFAs的利用途径被进一步深入研究，发现偶数碳VFAs优先被利用，奇数碳VFAs后被利用；其主要原因是乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）和丙酰辅酶A（Propionyl-CoA）利用率的不同。乙酰辅酶A是HB和HV合成必要的前体物，而丙酰辅酶A只在HV合成时需要，这导致了对乙酰辅酶A的需求增加，乙酰辅酶A在合成PHA过程中消化速率增快，进而导致其前体物偶数碳VFAs的消耗速率增加［63］。

3.2 供氧量（DO）对合成PHA的影响

活性污泥法合成PHA过程中，供氧条件主要分为缺氧、微氧和好氧条件；DO含量对产物合成量有明显的影响。Reddy等［59］和 Wang等［64］均发现在缺氧条件下的PHA生产率高于好氧条件，证明了PHA生产需要更低的DO含量。但不同的是Wang等发现VFAs消耗速率在缺氧条件下高于好氧条件；而Reddy等发现好氧条件更易使微生物利用碳源进行细胞生长，VFA利用率在好氧条件下高于缺氧条件。此外，各学者在DO含量较低的条件下进一步探究了PHA产量变化，Wang等［65］和Wijeyekoon 等［66］均发现随着 DO 浓度在缺氧条件下进一步降低，底物吸收速率、PHA积累速率、转化率和产量均下降。目前众多研究均表明，在氧含量低的情况下更有利于合成PHA，但具体的供氧量需要进一步确定。

3.3 C/N对合成PHA的影响

活性污泥法合成PHA过程中碳元素和氮元素的含量对于产物积累有明显的影响，氮元素是微生物生长和细胞增殖所需要的重要物质。C/N上升会促进PHA的积累，但对细胞生长有相反的影响，限制氮元素含量会使微生物酶活性受到抑制，进而在活性污泥细菌体内积累PHA［11］。因此，为了获得较高的PHA产量，应该在微生物生长和PHA积累之间找到平衡。

Ahn等［67］和Wen等［68］均认为严格限氮条件（C/N＞100）比含氮条件下PHA产量高。但Jia等［69］探究了一种新的合成PHA方法，在低C/N条件下（C/N=10）合成PHA，其产量接近严格限氮条件下产量；并发现通过不同的方法驯化细菌群落可以在氮充足的底物中大量合成PHA。该实验为合成PHA提出了新的方法，可以在节省合成前体物混合液脱氮成本的同时达到较高的PHA合成产量，从而降低了PHA生产成本。

3.4 温度对合成PHA的影响

反应过程温度是合成PHA的一个重要影响因素，在大规模合成PHA的过程中，提高合成过程的温度需要消耗大量能量并产生高昂费用，因此温度对于合成PHA的影响需要进一步被探究，以达到提升合成PHA效率的目的。Grazia等［70］和Valentino等［71］均发现随着温度上升更多的有机物被用于维持微生物活性，导致PHA产量降低；并认为在15～30℃的范围内展现了最好的PHA产量。因此，从底物利用的角度来看，混菌培养PHA的生产在较低的温度下更有效。

3.5 pH对合成PHA的影响

pH值是在合成PHA过程中最重要的参数之一，Kourmentza等［60］发现在初始pH值为6.9时合成PHA含量达到最大值，随着pH值上升至7.25和7.5时，PHA产量降低。Li等［72］也发现PHA的合成量在中性条件下最高。此外，Villano等［73］发现了相反的趋势，随着反应pH值从7.5上升至8.5和9.5，PHA产量也随之增大；并且随着反应体系pH值增加，共聚物中的HV含量上升。针对目前活性污泥法合成PHA工艺研究发现，pH值对于PHA产量的影响还没有明确的规律，其原因可能是由于不同的pH值对复杂微生物群落结构产生影响，进而改变了PHA的合成量及类型；在后续关于活性污泥法合成PHA的研究中，pH值的影响还需要进一步被讨论。

3.6 前体物中非VFAs类物质对合成PHA的影响

有机质厌氧酸化液是一个复杂体系，尽管VFAs作为高质量碳源占该体系内SCOD总量的40%～70%，除VFAs外还存在多种物质，如包括可溶性蛋白质、可溶性碳水化合物等，约占其余的30%～50%［24，61］。Morgan-Sagastume等［74］发现在添加前体物中VFAs被耗尽时，PHA的合成量达到最大值；由于非挥发性脂肪酸被微生物摄取明显较慢，所以对PHA的合成贡献较小。也有学者认为，PHA前体物中蛋白质含量较高时，活性污泥混合体系中氮含量升高，对合成PHA产量具有负面影响［19］。但是，Liao等［25］对厌氧发酵液中非VFAs有机物质对PHA合成的影响有不同的观点，认为PHA合成菌也可以在低VFAs浓度下使用其他有机物用于微生物的生长和繁殖，亦可用于PHA的积累。研究发现活性污泥体系对COD的消耗在短时间内超过40%，且可以合成相同产量的PHA。

除此之外，NaCl等物质也可能存在于厌氧发酵液中，也对PHA合成存在影响。Palmeiro-Sánchez等［75］探究了NaCl对于PHA积累的影响，发现在浓度为7、13和20 g/L的条件下均导致PHA产率下降，随着浓度的上升对于PHA合成抑制越明显；并且会降低HV的含量，这是因为丙酸在NaCl存在的条件下，更多被用于产生ATP来维持细胞生长时。厌氧酸化液中非VFAs类物质较多，且部分物质对PHA合成的影响机理较为复杂，需要广大学者进一步探索。

4 结语

PHA作为一种绿色友好型塑料，在其生产和降解方面均具有积极的社会和环境影响。利用厨余垃圾合成PHA，一方面可以开发一种有机质垃圾资源化利用的新模式；另一方面可以进而合成生物可降解材料可替代传统石油基塑料，降低资源消耗和环境污染。使用有机质含量丰富的厨余垃圾作为碳源生产PHA将会是一个新型研究热点。本综述汇总了PHA的不同分类及其在不同行业中的应用价值。阐明了利用厨余垃圾合成PHA前体物，进而合成PHA的工艺流程及内在机制。此外，还重点讨论了厨余垃圾合成PHA前体物及混合菌群合成PHA的工艺影响因素，总结了诸多工艺参数对两个反应阶段的影响。基于对过往研究的梳理，提出了利用厨余垃圾合成PHA的技术挑战和未来前景。

进一步研究利用厨余垃圾合成PHA的同时需要重点关注几个方面：（1）不同碳源合成的PHA类型不同，利用厨余垃圾合成乙酸、丁酸研究相对较多；但丙酸、戊酸作为HV的前体物，关于利用厨余垃圾定向合成丙酸、戊酸的研究很少，需要学者们进一步探索。（2）以厨余垃圾为碳源合成PHB在目前的工程应用中使用较少，而共聚物材料因具有较好的物理化学性质而被广泛使用，但对于调整PHA合成工艺参数，进而增加不同共聚物在系统内自然共聚的研究相对较少，还需要进一步探索合适的条件增加微生物体内PHBV的自然共聚。（3）厌氧酸化液中的非VFAs类物质对在PHA合成有明显的影响，但对其组成类型以及影响机理的研究还处在起步阶段，因此需要更明确地探索出厌氧发酵液中非VFAs类物质的基本组成和对于PHA合成的影响途径。