响应面法优化抗氧化剂复配组合

石艳宾，梁山，李文静，黄登禹*

1.天津天狮学院（天津 301700）；2.天津嘉汇捷瑞医药科技有限公司（天津 301800）

为增强抗氧化效果，在抗氧化剂中添加一种或几种其他抗氧化剂，使复配抗氧化剂各组分间特性互补、协调增效，从而大大提高抗氧化能力[1-3]。没食子酸丙酯（propyl gallate，PG）亦称棓酸丙酯，属于酚类化合物，具有显著的药理活性和生物活性，是一种常见的脂溶性抗氧化剂[4-5]，主要用于抗氧化和抗微生物等方面。茶多酚（tea polyphenol，TP）是茶叶中多羟基酚类化合物的总称[6]，是一种具有高抗氧化性和强抑菌性的天然提取物，易溶于水和有机溶剂，其抗氧化能力是维生素C的100倍，是维生素E的20倍，安全无毒、耐热性好，被广泛应用于植物蛋白饮料、蛋白固体饮料等制品中[7]。D-异抗坏血酸钠（D-sodium erythorbate）又名赤藻糖酸钠，是一种安全性高、性能优良的新型生物型抗氧化剂和护色剂，其防腐抗氧的效果优于VC，易溶于水，被广泛用于浓缩果蔬汁、饮料、葡萄酒、果酱等食品中[8]。Romano等[9]研究指出，迷迭香酸提取物和BHT等量混合后具有协同抗氧化作用以及抗菌活性的增效性。唐煜括等[10]研究发现汉中仙毫茶多酚与维生素C以特定比例混合后，自由基清除活性和抑菌性均有显著提高。王鹏等[11]研究黑木耳中多糖和类黄酮的协同抗氧化作用，自由基清除能力随着复配液质量浓度增大而增强。Hait-Darshan等[12]从菠菜叶中分离提取了一种天然抗氧化物质（NAO），结果发现咖啡酸和儿茶素与NAO复配具有更好的抗氧化协同效果。Jaswir等[13]将响应曲面法应用于抗氧化协同作用分析，为复配抗氧化剂的配比筛选提供了依据。Zhang等[14]从扁豆中提取出类胡萝卜素和生育酚，结果发现二者之间具有协同抗氧化作用。随着食品种类的不断丰富，单一抗氧化剂不能满足食品行业的发展要求，因此复配抗氧化剂是已逐渐成为时代抗氧化剂发展的必然趋势。依据GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》，筛选出用于糖果包衣中的抗氧化剂没食子酸丙酯、茶多酚，并辅以一定量兼具抗氧化与护色作用的D-异抗坏血酸钠，利用响应面法优化出复配抗氧化剂组合，为复配食品抗氧化剂在食品抗氧化防护应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-抗坏血酸（纯度≥99）、没食子酸丙酯（纯度≥98%）、茶多酚（纯度≥97）、D-异抗坏血酸钠（纯度≥98%），上海麦克林生化科技有限公司；DPPH（纯度≥99.99%），梯希爱上海化成工业发展有限公司；无水乙醇（分析纯），天津市汇杭化工科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV1000紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司；AL204分析天平，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；SB-3200DTDN超声波清洗机，广州谱立奇仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除能力测定

将VC、茶多酚、PG、D-异抗坏血酸钠配制成5，10，20，30，40，50，60，70，80，90和100 μg/mL系列样品溶液，以VC为对照，采用DDPH法测定抗氧剂样品自由基清除率，分析3种抗氧化剂的抗氧化性能。分别移取0.5 mL待测样品溶液、70%乙醇溶液，加入5 mL浓度为0.06 mmol/L DPPH溶液，混合混匀后静置反应30 min，在吸收波长515 nm处测定系列样品溶液反应后Ar、空白对照Ac；移取0.5 mL待测样品溶液和5 mL 70%乙醇溶液，混合混匀后静置反应，测定样品底液Ax[15-16]。根据式（1）计算VC、PG、茶多酚、D-异抗坏血酸钠样品的DPPH自由基清除率SR值，制作抗氧化剂浓度与自由基清除率SR值曲线图，计算半数清除率IC50值。

1.3.2 响应面试验

根据茶多酚、没食子酸丙酯、D-异抗坏血酸钠DPPH自由基半数清除率IC50值及食品添加剂使用控制要求[17-18]，3种抗氧化剂的优水平分别为10，15和35 μg/mL。采用Design Expert 10软件，设计Box-Behnken因素水平编码表1，进行响应面分析试验，分析3种抗氧化剂对DPPH自由基清除率SR值的影响。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平编码表单位：μg/mL

2 试验结果与分析

2.1 茶多酚、PG、D-异抗坏血酸钠DPPH自由基清除能力分析

依据试验方法1.3.1小节，测定TP、PG、D-异抗坏血酸钠系列浓度样品溶液SR值，绘制抗氧化剂质量浓度与自由基清除率SR间的曲线图，得到抗氧化剂回归方程与R2，计算TP、PG、D-异抗坏血酸钠半数清除率IC50值，详见图1和表2。由图1和表2可知，抗氧化剂TP、PG、D-异抗坏血酸钠对DPPH自由基均有较强的清除作用，清除率SR值随着样品浓度的增大而增强，但达到60 μg/mL，DPPH自由基清除率能力增长缓慢。将TP、PG、D-异抗坏血酸钠清除能力与对照VC进行比较分析可知，抗氧化剂在60 μg/mL以下质量浓度下茶多酚TP、PG对DPPH自由基的清除作用强于VC，D-异抗坏血酸钠弱清除能力弱于VC。

表2 TP、PG、D-异抗坏血酸钠和VC回归方程与半数清除率

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验设计与结果

在分析TP、PG、D-异抗坏血酸钠清除自由基能力作用的基础上，依据因素水平编码表1进行Box-Behnken响应面试验设计，分析TP、PG、D-异抗坏血酸钠对DPPH自由基清除率的影响，Box-Behnken响应面试验结果见表3。

表3 Box-Behnken试验设计与结果

2.2.2 响应面试验结果方差分析

应用Design Exper 10对响应面试验结果表3中试验数据进行回归分析，方差分析结果详见表4。没食子酸丙酯（A）、茶多酚（B）、D-异抗坏血酸钠（C）的p值均小于0.01，表明这3个因素对DPPH自由基清除率的影响非常显著。A、B、C三个因素间存在一定的交互作用，但只有A与C间交互作用对DPPH自由基清除率的影响显著，A与B、B与C间交互作用较小。

表4 回归模型方差与分析

2.2.3 回归模型的建立及抗氧化性分析

对响应面试验结果进行回归分析，建立全变量二次回归模型：

由表4可知：模型p＜0.01，表明回归模型非常显著；失拟项p=0.508 8＞0.05，即失拟项不显著，表明该模型是适合没食子酸丙酯、茶多酚、D-异抗坏血酸钠协同抗氧化分析的数学模型。试验的校正R2值为0.950 9，表明回归方程的拟合度较好。回归方程系数的显著性结果表明：A、B、C对DPPH自由基清除率的影响非常显著，对DPPH自由基清除率影响依次B、A、C；AC、C2对DPPH自由基清除率的影响显著。因素A、B一次项系数为正值，表明A、B对DPPH自由基清除率有正相关性，因素C一次项系数为负值，表明C对DPPH自由基清除率有负相关性；A与B交互项系数为正值，表明两因素间对DPPH自由基清除率存在正协同作用；A与C、B与C的交互作用系数为负值，表明两因素间对DPPH自由基清除率存在负协同作用。

2.2.4 响应面交互作用分析

应用Design Expert 10对表3数据进行分析，并绘制出响应曲面图2~图4。随着抗氧化剂质量浓度的增加，DPPH自由基清除率SR值也随着增大。同时，响应曲面坡度比较陡峭，说明抗氧化物质对DPPH自由基清除率的影响显著，茶多酚的清除效果明显强于没食子酸丙酯。从3个响应曲面图也可以看出，虽然没食子酸丙酯、茶多酚、D-异抗坏血酸钠间存在一定的交互作用，但因素没食子酸丙酯与D-异抗坏血酸钠间存在负协同作用，导致响应面试验设计部分复配组合随着两种抗氧化剂质量浓度增大出现自由基清除率降低现象。

图2 A和C对DPPH自由基清除率的影响

图3 A和B对DPPH自由基清除率的影响

图4 B和C对DPPH自由基清除率的影响

2.2.5 优化配方验证试验

采用单因素试验和响应面试验确定优化复配组合：没食子酸丙酯14.90 μg/mL、茶多酚15.00 μg/mL、D-异抗坏血酸钠40.00 μg/mL。为了便于实施试验，将配方参数修正为没食子酸丙酯15 μg/mL、茶多酚15 μg/mL、D-异抗坏血酸钠40 μg/mL，重复试验进行3次验证，取平均值，结果为58.647%，表现出较好的抗氧化效果，证明该复配组合为较优方案。

3 结论

没食子酸丙酯、茶多酚为典型的酚型抗氧化剂，D-异抗坏血酸钠兼具抗氧化与护色作用。经比较，没食子酸丙酯、茶多酚抗氧化性强于对照品VC，D-异抗坏血酸钠弱于VC。利用响应面法分析可知，没食子酸丙酯、茶多酚、D-异抗坏血酸钠对DPPH自由基清除作用显著，没食子酸丙酯与D-异抗坏血酸钠间交互作用显著，且为负协同作用。最佳配方为没食子酸丙酯15 μg/mL、茶多酚15 μg/mL、D-异抗坏血酸钠40 μg/mL，DPPH自由基清除率为58.647%，抗氧化效果较好。复配抗氧化剂是我国食品添加剂的发展方向，在今后还需要根据食品添加剂使用要求进行大量试验，寻求具有典型抗氧化性并能够对产品进行护色作用的复合抗氧化剂。