食物过敏原酶联免疫检测技术研究进展

彭斓兰，朱永智，李靖，桑丽雅，王元凤，魏新林*

1.上海交通大学农业与生物学院（上海 200240）；2.上海师范大学生命科学学院（上海 200240）；3.杭州南开日新生物技术有限公司（杭州 310051）

食物过敏（food allergy）是指由食物的某种特定成分造成的对食物的不良反应[1-3]。食物过敏易难以根治，通常并发哮喘等特应性疾病，在某些情况下甚至威胁生命[4-5]。近年来，随着食品加工储运和流通的快速发展，人们的生活环境和食物类型发生巨大变化，遭受食物过敏性疾病的人数大量增加，食物过敏性疾病成为一个全球性、公众性的卫生问题[6-8]。目前，食物过敏尚无有效的治疗手段，只能通过严格避免摄入含有过敏原的食物预防。

食物过敏原是导致食物过敏的直接原因，其化学本质是食物中的水溶性或盐溶性糖蛋白，除果蔬过敏原外，通常具有耐热、耐酸、耐酶解的特性[9]。据报道，具有致敏性的食物有170余种，其中引起重大过敏反应的食物主要是牛奶、鸡蛋、花生、小麦、大豆、坚果类、鱼和甲壳类8种[10-12]。对于食物中过敏原的检测技术手段主要有体内检测、体外检测和仪器检测[13-15]。与体内检测和仪器检测相比，体外检测分析技术在食物过敏中的应用更为广泛。根据过敏原标记物的差异，体外检测通常是指基于抗原和抗体特异性结合的免疫学检测方法和通过过敏原核酸的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）实现的检测法[16]。酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是食物过敏原检测中使用最为广泛的免疫学检测方法之一。随着食物过敏患者人数及发病率的增加，有必要在食品标签中标识食物过敏原，以减少食品过敏患者食用的过敏率，因此检测食物过敏原，开展食品过敏原检测方法研究具有重要意义。

简要综述ELISA检测牛乳、鸡蛋、花生等食物过敏原的研究，并对未来发展趋势进行展望，为促进食物过敏原检测方法的研究和相关产品的开发提供理论基础。

1 酶联免疫分析基本理论和原理

酶联免疫吸附测定（ELISA），通过酶促反应产生的信号用于检测和定量溶液中特定物质的量。ELISA通常用于检测抗原，也可用于包括抗体、激素和药物在内的其他物质的检测。

酶联免疫分析的原理具体：在保证抗原（或抗体）免疫活性完整的情况下，将抗原（或抗体）在物理吸附作用下结合到固体载体表面；在保证酶标抗体（酶标抗原）的酶活性和免疫活性完整性的前提下，抗体（或抗原）与酶标抗原（或酶标抗体）在化学键的作用下进行偶联作用；酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，加入底物，底物在酶的催化作用下变色，通过颜色深浅可以判断是否存在免疫反应，以及免疫反应性。也可用酶标仪测定A450nm，建立标准曲线用于定量检测分析[17]。酶作为催化剂，起到催化化学反应、放大化学信号的作用，提高检测灵敏度[18]。

2 酶联免疫分析的类型

为进一步提高检测灵敏度、特异性等优势，衍化出不同的酶联免疫吸附测定方法，如夹心ELISA、竞争/抑制ELISA、直接ELISA和间接ELISA等。各类型具备不同特点，适用的检测条件也不同。

2.1 夹心ELISA

夹心ELISA需要使用配对抗体（捕获抗体和检测抗体），因此每种抗体都需要对抗原的不同且不重叠的区域或表位具有特异性。夹心ELISA中对匹配的抗体对进行特异性测试，确保它们能够检测到不同的表位，以达到准确的结果。夹心ELISA的程序：在96孔酶标板加入分析物或样品，用捕获抗体包被；加入检测抗体，检测抗体可以是酶缀合的，在这种情况下，被称为直接夹心ELISA。如果所使用的检测抗体未标记，则需要第二酶偶联的检测抗体，这被称为间接夹心ELISA。由于使用了2种抗体检测抗原，可以同时使用直接方法和间接方法，夹心ELISA还具有高特异性和灵活性。此外，夹心ELISA灵敏度是直接或间接ELISA的2~5倍。夹心ELISA通常适用于复杂样品的分析，因为抗原无需在测定前进行纯化，但结果仍具有较高的灵敏度和特异性。

2.2 竞争/抑制ELISA

竞争/抑制ELISA也称为封闭ELISA，是一种复杂技术，适合小抗原。竞争/抑制ELISA主要用于通过检测预期信号输出中的干扰来测量样品中抗原或抗体的浓度。本质上，样品抗原或抗体分别与参照物竞争结合有限量的标记抗体或抗原。样品抗原浓度越高，输出信号越弱，表明信号输出与样品中抗原量呈反比。这种形式最适合不能同时结合两种抗体的低分子量化合物。测试线无颜色表示分析物的存在，而测试线和对照线均显示颜色表示阴性结果。

2.3 直接ELISA

直接ELISA检测比其他ELISA所需的步骤更少，不需要潜在的交叉反应的第二抗体，检测要快得多，也不太容易出错。由于抗原的固定不是特异性的，因此直接ELISA可以观察到更高的背景噪音，样品中的所有蛋白质（包括目标蛋白质）都会结合到酶标板上，而每种靶蛋白都需要特异性的偶联一抗，因此，直接ELISA的灵活性较差。直接ELISA不使用二抗，没有信号放大，检测的灵敏度不高。当需要分析对抗原的免疫反应时，通常使用直接ELISA技术。

2.4 间接ELISA

间接ELISA是将抗原包被吸附到96孔酶标板中。检测时，未标记的一抗结合至特定抗原，应用针对一抗的宿主物种的酶缀合的二抗。间接ELISA具有更高的灵敏度，因为不同的一抗可与单个标记的二抗一起使用。此外，间接ELISA需要的标记抗体更少，因而更经济。但是二抗与包被的抗原有可能发生交叉反应，或许会增加背景噪音。由于需要额外的二抗孵育步骤，间接ELISA分析比直接ELISA花费的时间更长。间接ELISA通常用于检测确定样品中的总抗体浓度。

3 食物过敏原酶联免疫检测技术研究进展

牛乳是八大主要过敏性食物之一，在食品加工中被广泛添加到各类食品中，因此研究牛乳过敏原的检测方法十分必要。尽管牛乳中的致敏蛋白质超过30种，但是酪蛋白和乳清蛋白被认为是主要过敏原[27]。β-乳球蛋白在牛乳总蛋白（10%）和乳清蛋白（50%）中的占比很高，牛乳过敏患者中对β-乳球蛋白过敏的人数占比约82%[19]。因此，β-乳球蛋白的免疫学检测方法研究受到科研工作者的关注。为检测β-乳球蛋白，陈献雄等[20]以β-乳球蛋白免疫BALB/c小鼠，建立可检测β-乳球蛋白的双单克隆抗体夹心法ELISA。该方法在15.63~50 ng/mL范围内线性良好。袁水林等[21]以β-乳球蛋白标准品为包被抗原，以自制抗体为一抗，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG：HRP为二抗，以邻苯二胺为底物，建立一种间接竞争ELISA（线性检测范围为1~1×103ng/mL），反相高效液相色谱法（RP-HPLC）进行验证，结果表明2种方法的检测结果具有良好一致性。与陈献雄等[20]的方法相比，该方法检测β-乳球蛋白线性范围更宽，检出低线更低，因此，检测结果更为准确，适用性更强。除β-乳球蛋白外，α-乳白蛋白也是牛乳中常见的过敏原，部分敏感人群对2种甚至多种牛乳过敏原敏感。张忠华[22]以牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白免疫新西兰大白兔，优化ELISA条件，建立牛乳β-乳球蛋白和α-乳白蛋白检测的间接竞争ELISA，其最适检测范围分别为10~1×103ng/mL和50~1×103ng/mL。为了研究食品热加工对食物过敏原致敏性的影响，Negroni等[23]制备针对热处理和天然β-乳球蛋白的单克隆抗体，分别建立可检测食品中热处理和天然β-乳球蛋白的夹心ELISA方法，该方法对天然β-乳球蛋白和热处理过的β-乳球蛋白的检测范围分别为0.05~5 ng/mL和0.2~20 ng/mL，2种方法的检出限和检测范围有明显区别，可能是热处理导致β-乳球蛋白的致敏位点变化，影响其致敏性。

鸡蛋被誉为“全营养食品”是重要的营养来源。然而，食用鸡蛋及其制品也常引发过敏反应，患病率在1%~2%[24]，蛋清和蛋黄均含有过敏原[25-26]，但是蛋清更容易引起过敏反应[27]。常见的、致敏性较强的鸡蛋过敏原通常是指卵白蛋白和卵类黏蛋白[25]。张世伟等[28]建立以单克隆抗体为包被抗体、多克隆抗体（辣根过氧化物酶标记）为二抗的卵白蛋白双抗夹心ELISA方法，该方法检测结果稳定可靠（检出限10 ng/mL，IC50260 ng/mL），基本可以满足食品中鸡蛋过敏原准确、快速检测的需要。梁汭[29]通过间接EILSA或竞争抑制ELISA检测去折叠前后卵类黏蛋白的兔血清IgG结合能力和鸡蛋过敏患者血清IgE结合能力，以评估糖化卵类黏蛋白的免疫反应性，寻求通过食品级加工技术获得低致敏卵类黏蛋白产物，探究其表位与致敏性变化的关系，为低致敏或脱敏鸡蛋产品的研发提供理论指导。

花生富含不饱和脂肪酸，具有很高的营养价值，是重要的油料作物之一[30]。但花生也是常见的八类致敏食物之一，花生导致的过敏在成年人中的发病率高达4%~8%[31-33]。吉坤美等[34]通过花生总蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体，建立可特异性检测食品中花生过敏原的双多抗体夹心ELISA试剂，该方法具有较低的检出限（8 ng/mL），用该方法检测产自中国、美国和日本等地的15种食品并与相应的食品标签对比，绝大部分食品的检测结果符合过敏原标注。高纯度的花生过敏原Arah6用于免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，建立间接竞争ELISA，其中包被原为高纯度的Arah6，自制抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为二抗，该检测方法适用于食品中花生现场快速检测[35]。尽管加热会改变食物原料中蛋白质的结构，但仍是食品加工中最常用的方式。在免疫学方法检测食物过敏原时，加热同样会导致蛋白质（过敏原）的结构变化，致使抗体无法正确识别被检测的过敏原，产生假阴性现象[36]。周红菲[37]采用不同的热加工方式处理新鲜花生、分离花生蛋白，利用质谱分析酶解肽段信息，结合相应过敏原蛋白的空间结构模型和过敏原表位，分析其空间结构和潜在致敏性的变化。

全世界35%~40%的人口以小麦为主粮，近年来小麦过敏原诱发食物过敏症的发病率正在逐年升高[38]。一般来说，小麦过敏可引发过面包师哮喘症、敏性休克等症状，严重时还有生命危险[39]。ELISA方法是检测小麦过敏原常用的方法之一，具有简便快速、灵敏的优势[39]。但是，由于样品容易交叉污染，导致假阴性或假阳性结果频繁出现，降低了过敏原定量检测的准确率[40]。Diaz-Amigo等[41]还发现抗体特异性、提取程序、参考材料及其结构相似物均对ELISA检测结果产生不同程度的影响，ELISA检测面筋蛋白的测定限在mg/kg量级。赵凯等[42]用自制小麦球蛋白单克隆抗体和多克隆抗体，建立一种不与其他物种的蛋白发生交叉反应的双抗夹心ELISA方法，该方法的特异性和灵敏度良好。

大豆及其副产品营养价值高、物理化学性质良好，是食品工业中不可或缺的油料作物和植物蛋白质来源。大豆是常见的八类过敏性食物之一，大豆过敏原的研究备受关注[43]。大豆球蛋白被认为是大豆中主要的过敏原，将纯化的大豆球蛋白作为免疫原制备单克隆抗体，开发出一种竞争性ELISA方法，该方法重现性良好，可灵敏地测定大豆球蛋白用于评估食品中的大豆过敏性[43]。布冠好等[44]通过大豆球蛋白（纯品）免疫新西兰大白兔，制备兔抗大豆球蛋白多克隆抗体，建立可特异性检测大豆球蛋白的间接竞争ELISA法。该方法的具有一定灵敏度和重复性，线性范围为0.01~0.05 μg/mL，可用于大豆蛋白制品过敏原的检测。

4 结语与展望

近年来，食物过敏的发病率逐年增长，过敏人群的生活受到严重影响。以抗原抗体特异性结合为基础的酶联免疫法能够快速、准确地对食物过敏原进行定性和定量分析，还可以检测天然蛋白质和酶解的蛋白质片段。针对牛奶、鸡蛋、花生、小麦、大豆等常见过敏性食物的酶联免疫检测方法逐步得到建立和完善，并且在食物过敏原的检测中发挥重要作用。

酶联免疫法研究的关键在于致敏蛋白抗体的制备，优质的抗体能够保障检测方法的特异性，应用新型纳米材料或标记物，或许能够丰富酶联免疫法的类型。在食物过敏原的研究方面，筛选不同食物原料的标志性过敏原，解析其结构和物理化学特性，明晰特定致敏位点，检测食物过敏原的致敏性残基，降低高温等加工工艺和食物过敏原交叉反应对检测结果的影响等，是未来研究的重要方向，不仅可以为建立健全食品标签中过敏原标识体系提供支撑，还可以指导低致敏食品的研发。