ncRNA在心肌细胞增殖中作用的研究进展

纪志豪，张曦，余云生

(苏州大学附属第一医院，江苏 苏州 215006)

目前，急性心肌梗死仍然是中国乃至全世界最主要的死亡原因[1- 2]。心肌梗死通常为在冠状动脉粥样硬化的基础上因急性、持续性缺血缺氧造成氧供需失衡所致的心肌细胞死亡[3]。如果心肌梗死后几分钟内迅速恢复冠脉血流，缺氧对心肌细胞所造成的影响是完全可逆的，但动物模型证实，缺血长达20 min即可对心肌造成不可逆损伤[4- 5]。不同于蝾螈和斑马鱼等低等脊椎动物有着强大的再生能力来修复受损心肌，哺乳动物心肌细胞高度分化，无法进行细胞分裂，成年后心脏无再生能力。损伤后的心肌会被细胞外基质网状结构和一些增生的细胞代替，形成瘢痕组织，损害心肌收缩力[6]。然而已有研究证实成年人类心肌细胞仍具有增殖能力，每年以较低的速率进行更新，并随着年龄增加而降低[7]。最近一例案例报道表明，一名刚出生的新生儿发生严重的心肌梗死后在1个半月时间内心功能完全恢复正常，并且在1年的随访中与同年龄的健康婴儿无差异[8]。此外，测序技术成本的降低导致越来越多的非编码RNA(non- coding RNA，ncRNA)被发现，其中较多的ncRNA具有心脏特异性，与心脏再生修复联系密切。通过调节这些ncRNA在体外和体内模型中的表达，证明其足以促进心肌细胞自主增殖反应的发生。本文作者简单概括ncRNA在心肌细胞增殖中的作用，探讨未来临床转化应用的可行性。

1 ncRNA调控

ncRNA是指不被翻译成氨基酸序列的RNA，主要包括微小RNA(mirco RNA, miRNA)、长链非编码RNA(long non- coding RNA, lncRNA)和环状RNA(circular RNA, circRNA)。到目前为止，许多研究表明ncRNA在心脏发育和心肌细胞增殖中发挥重要作用[9- 10]。1993年从线虫中首次发现miRNA并命名为Lin- 4，miRNA开始进入生命科学领域的研究[11]。越来越多的研究证实miRNA在促进内源性心肌细胞增殖和心脏再生中发挥重要作用。相反，lncRNA因发现较晚，目前对其在心肌梗死等方面的研究不如miRNA，虽然绝大部分lncRNA的生物学功能尚不清楚，但已成为心血管领域的研究热点。

1.1 miRNA

miRNA是一类长度约为22个核苷酸的ncRNA，主要通过抑制蛋白质翻译或诱导靶mRNA失稳来控制转录后基因的表达而发挥生物学作用。近十年来，大量的体外和体内研究已经发现了miRNA在心脏的发育和心血管疾病中的作用，并证实其通过作用不同的靶点调节靶基因的表达，从而调控着心肌纤维化、凋亡和细胞增殖等[12]。Eulalio等[13]进行的高通量筛选发现204种miRNA可以促进新生心肌细胞增殖，并通过实验证明hsa- miR- 590和hsa- miR- 199a可以靶向抑制同源域蛋白同源盒(HOPX)促进新生小鼠和大鼠的心肌细胞重新进入细胞周期，使心肌细胞数量显著增加，还能减少梗死面积，诱导心脏再生。Cd151可以诱导p38表达，是心肌细胞增殖的抑制因子，同时也是miR- 199a的直接作用靶点。miR- 199a抑制Cd151表达，从而下调p38促进小鼠心肌细胞增殖[14]。随后，又有研究利用腺病毒载体将miR- 199a导入梗死的猪心脏，刺激心肌细胞增殖，改善心肌收缩力[15]。miR- 15家族中的miR- 195是心脏发育中细胞周期蛋白表达的重要调节因子，miR- 195通过抑制一些参与G2/M期转变和有丝分裂过程的细胞周期基因(如Chek1)来阻止心肌细胞的增殖[16]。研究[17]表明,小鼠出生到成年时期抑制miR- 15家族的表达可增加心肌细胞增殖，并改善心肌梗死后左心室收缩功能。miR- 30和miR- 141是通过抑制Cyclin A的表达阻止细胞周期进程[18]。miR- 29a可以抑制Cyclin D2的表达，通过抑制miR- 29a诱导大鼠心肌细胞增殖，加速G1/S和G2/M的转换[19]。而miR- 133a可以抑制血清反应因子和Cyclin D的表达，miR- 133a的表达缺失会导致小鼠心肌细胞异常增殖[20]。miR- 302/367家族对于哺乳动物心脏生长发育极为重要，在小鼠胚胎期高度表达，成年期几乎不表达。miR- 302/367缺失的小鼠心室壁发育不良，心肌细胞增殖减少。过表达miR- 302/367导致小鼠心肌梗死后瘢痕减少，诱导心肌细胞增殖并且修复心功能。河马信号通路(the Hippo pathway，HIPPO)由一系列保守的激酶构成，通过激酶级联反应调控细胞增殖和凋亡来控制器官体积。最近几年研究表明HIPPO信号通路抑制心肌细胞增殖，控制心脏大小，并且和心脏再生密切相关[21- 22]。miR- 302/367通过靶向抑制HIPPO信号通路中的Mst1、Lats2和Mob1B来抑制YAP磷酸化，与转录增强相关结构域(TEAD)结合促进小鼠心肌细胞增殖[23]。越来越多的研究支持miRNA具有作为再生靶点的能力，同时因其分子量小、目标基因明确引起广泛关注[24]。然而，miRNA因为复杂的多效应可能导致生物脱靶效应[25]。只有更加深入了解分子靶点，才能研发出高效、安全的miRNA产品。

1.2 lncRNA

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，最初被认为是没有生物学功能的RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物[26]。近年来，越来越多研究揭示了lncRNA参与了许多生物学过程，例如调节疾病表观基因、组蛋白修饰、染色体沉默和免疫反应等[27- 30]。在心脏发育过程中，一些lncRNA发挥着调节心肌细胞分化、增殖、凋亡和心肌肥大等生物学功能[9,31]。lncRNA同样通过正性或负性调节心肌细胞周期来调控发育和增殖。内源性心脏再生相关调节因子(ECRAR)在胎儿心脏中表达较高，出生后逐渐降低。过表达ECRAR可以促进成年大鼠心肌梗死后心肌增殖，使毛细血管密度增加，减少梗死面积，抑制纤维化。研究发现ECRAR受转录因子E2F1调控，可被其转录上调。而且，ECRAR可以直接与细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)结合，促进其磷酸化并易位到细胞核内，诱导Cyclin D1、Cyclin E和E2F1的激活，形成一个正反馈通路，并加速G1/S转变，激活细胞周期再进入[32]。心肌细胞再生相关lncRNA(CRRL)在胚胎时期表达最低，在成年期表达最高。被敲除CRRL基因的大鼠在心肌梗死后心肌细胞增殖率升高，梗死区面积减少，心功能较前改善。过表达CRRL则抑制心肌细胞增殖。CRRL通过海绵效应竞争性结合miR- 199a，上调靶基因HOPX，抑制心肌再生[33]。成人体内的心肌细胞增殖调节因子(CPR)是一种表达量远远高于胚胎期的lncRNA，CPR作为心肌再生的负调控因子，可降低心肌增殖能力。体内实验证明，CPR的沉默会增加小鼠心肌细胞增殖水平，加速细胞增殖并增强左室收缩能力，修复心功能。研究[9]证实，CPR通过与DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)相互作用，诱导微小染色体维系蛋白3(MCM3)甲基化，降低MCM3表达。MCM3是CPR的作用靶点，正性调节心肌细胞的增殖和再生。反义lncRNA(antisense lncRNA，AS lncRNA)是指蛋白编码基因的反义链转录，并与该基因的mRNA重叠的RNA[34]。沉默信息调节因子2相关酶1(Sirt1) AS lncRNA在体外心肌细胞过表达时，可以促进去分化和增殖。成年小鼠体内过表达Sirt1 AS lncRNA，激活心肌细胞重新进入细胞周期进行分裂。诱导心肌梗死后，Sirt1 AS lncRNA可以提高存活率，减少心肌梗死瘢痕面积并改善心功能。Sirt1双向调节心肌细胞活动，过高表达会增加氧化应激损伤心肌；而过低表达可以对抗氧化，减少凋亡，促进增殖。Sirt1 AS lncRNA通过结合Sirt1 mRNA增强稳定性，并调控Sirt1低表达水平，正向调节心肌细胞增殖[35]。上述研究表明lncRNA在调节心肌细胞增殖中具有重要作用。作为近几年新兴的研究目标，随着复杂的作用机制逐渐被发现，我们对lncRNA有了更深层的认识，也证明了其作为心肌细胞增殖和心脏再生修复的治疗靶点的巨大潜力。

1.3 circRNA

circRNA与其他ncRNA结构不同，是一种特殊的ncRNA分子。circRNA的3′端和5′端闭合起来形成环状结构，不易受RNA外切酶影响，因此在生物体内表达稳定且不易降解[36]。circRNA通过调控RNA结合蛋白或者充当“miRNA海绵”抑制靶基因来发挥生物学作用[37- 38]。随着对circRNA的深入研究，发现许多circRNA参与心血管系统的调节，例如心肌肥大、衰老与凋亡[39]。然而，促进心肌细胞增殖的circRNA目前只发现1种。Huang等[40]通过RNA测序和超级增强子数据在成人、大鼠和小鼠心脏中发现1个高度保守的circRNA:circNfix，在成年心脏中高度表达。敲除circNfix基因，体外心肌细胞呈去分化表现，并进行细胞分裂。此外，可提高H2O2处理后心肌细胞的存活率。沉默成年小鼠体内circNfix表达，可以诱导心肌细胞去分化、增殖和再分化。进一步敲除心肌梗死小鼠的circNfix后，观察到梗死边界区增殖细胞比例增加，心肌细胞凋亡减少，新生血管密度增加；过表达circNfix的小鼠梗死区面积增大，损害心脏再生过程。Meis1是细胞周期阻滞关键调控因子，可以结合并激活circNfix的超级增强子来调控circNfix表达。沉默Meis1可以降低circNfix表达，促进体内心肌细胞增殖。同时，降低circNfix表达也可以逆转Meis1对心肌细胞增殖的抑制作用。Y- 盒结合蛋白- 1(YBX1)是参与心脏再生的转录因子，通过增加细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B1促进细胞增殖。circRNA结合YBX1，使其滞留在细胞质，通过泛素化- 蛋白酶体途径降解YBX1。同时，circNfix作为miRNA- 214的分子海绵，促进糖原合酶激酶- 3β对β- catenin的降解作用，抑制β- catenin活性，调节心肌细胞增殖和血管形成[40]。如前所述，circRNA在心肌细胞增殖领域的研究刚刚起步，因其特殊的结构和较强的稳定性，已经成为科学家关注的热点。

2 ncRNA治疗的局限性

随着对心脏再生起源的研究，普遍认为新产生的心肌细胞来源于原有心肌细胞的增殖。调控内源性心肌细胞增殖的多种机制逐渐被发现，大量的心肌细胞增殖研究取得良好的成果。但因为存在尚未解决的潜在危险，还未应用到临床研究中。miR- 302/367持续过表达刺激小鼠心肌，虽然心肌细胞数量明显增多，但导致心脏肿大、心功能受损[41]。miR- 199a导入猪心脏后，心脏形态和功能逐渐恢复并趋于正常，但大部分猪在注射7～8周后突发室颤而猝死[15]。因此，通过刺激内源性心肌细胞增殖而修复心功能是可行的选择，但要严格控制干预时间和程度，充分考虑药物的靶向性、病毒载体是否具有致癌性以及持续的去分化作用对心脏的损伤。

3 结 语

目前临床上对于心肌梗死的治疗主要有药物干预、支架介入和冠脉搭桥等，晚期心脏衰竭可以选择左心辅助装置和心脏移植等治疗。无论是支架介入、搭桥还是左心辅助装置，都是恢复冠脉血流和改善心功能，无法修复或者补充坏死的心肌细胞。心脏移植因其供体稀缺、术后免疫排斥等问题难以广泛应用。大部分ncRNA具有高度保守性，在心脏中高度表达，并且是参与调控心脏生长发育以及再生网络的主要编辑者，因此，ncRNA在治疗心肌梗死和心脏再生中至关重要。与其他ncRNA相比，miRNA的研究处于领先位置。lncRNA和circRNA作为新的再生目标，在心脏中大量表达，具有极大的潜力和可行性，成为心脏再生领域中非常有吸引力的研究方向。随着测序技术和基因工程的进一步发展，越来越多的lncRNA和circRNA分子机制被挖掘，很大程度上与miRNA分子作用存在相互交叉调节的可能，例如Meis1可以同时作为miRNA[42](miR- 548c- 3p、miR- 509- 3p和miR- 23b- 3p)和circNfix的目标靶点，miR- 29、miR- 133和ECRAR同样可以作用于Cyclin D发挥不同的心肌细胞增殖效应。充分了解ncRNA分子间内在作用机制，运用更加精确有效的策略来调控心肌细胞增殖，有望在不久的未来将ncRNA应用到临床治疗中。