微胶囊的胰岛免疫隔离技术研究进展

李珅，张航与，刘波，李欣宇，高政南

（1.大连理工大学附属中心医院内分泌科，辽宁 大连 116000；2.大连理工大学电信学部生物医学工程学院，辽宁 大连 116024）

胰岛移植是治疗1 型糖尿病和脆性糖尿病的有效方案之一，但移植后患者需要终身服用免疫抑制剂等缺点，从而限制了胰岛移植的开展。为了克服胰岛移植的生物障碍，开发出具有一定治疗前景的封装策略。虽然胰岛封装不需服用免疫抑制剂，但由于长期缺乏胰岛素的生成等因素，此类方法限制了胰岛封装的临床应用。近年来，关于提高微囊化胰岛移植效果的研究逐渐增多，多种工程策略用于改善包封和移植后胰岛存活成为研究热点。因此，本文就免疫封装技术和新型微胶囊技术在胰岛移植中的应用进行综述，探讨微囊化胰岛移植存在的问题和潜在的改进方法，旨在为微囊化胰岛移植治疗糖尿病的临床应用提供参考。

近年来，由于饮食习惯的改变和生存压力的增大，糖尿病发病率逐年上升。1 型糖尿病和脆性糖尿病从病理生理角度上可以共同解释为胰岛细胞衰竭类疾病，该类疾病极大程度危害糖尿病患者的生存状态，造成血糖不稳，导致频发酮症酸中毒、全身并发症加重和低血糖。夜间无症状低血糖能够造成患者心律不齐和低钾血症，进而促使患者在睡眠中心脏不能正常复极化最终导致死亡，即临床中的“Dead in bed”［1］。目前治疗这种糖尿病最广泛接受的临床方法是注射外源性胰岛素［2］。然而，血糖波动控制不良以及伴随的诸如神经病变、肾病、视网膜病变、心脏病和动脉粥样硬化等并发症迫使人们寻找替代治疗方法［3］。器官或组织移植可以阻止并发症发生，胰腺移植是一种有效选择，但胰腺移植供体少、手术难度大、对患者损伤大且终身需要免疫抑制药物，因此推广困难［4］。相对来说，胰岛移植的侵入性较小，为外源性胰岛素治疗提供了一个有希望的替代方案［5-7］。

胰岛移植已被加拿大、澳大利亚以及美国个别单位批准为治疗1 型糖尿病和脆性糖尿病的标准方法。但是胰岛细胞移植患者仍需终身使用雷帕霉素为主的免疫抑制剂［8-9］。目前最有潜力解决这些问题的方法是改变组织免疫原性和免疫隔离［10-12］。科学家开发了免疫隔离策略以避免在胰岛移植中使用免疫抑制剂，下面对免疫隔离问题进行综述。

1 免疫封装技术概述

细胞免疫隔离策略是指使用选择性渗透膜将移植细胞或组织与宿主免疫系统分离［13］。这种选择性渗透膜或其他具有相似功能的封装材料可以阻止炎性细胞和大的免疫调节分子（例如抗体和细胞因子）进入。免疫隔离技术可以解决胰岛移植临床应用中的2 个主要障碍，即免疫抑制剂对患者的伤害，同时扩大胰腺供体来源［14-15］。免疫分离的概念可以追溯到1933 年，当时Vincenzo Bisceglie 描述了肿瘤细胞在聚合物中的成功封装［16］。封装是一种免疫隔离技术，治疗细胞或组织被包裹在选择性渗透生物材料中以逃避宿主免疫反应。一般来说，封装方法可分为血管内封装、血管外宏封装、血管外微（微胶囊）封装和纳米封装（胰岛表面涂层）。

1.1 血管内封装：装直接连接到血液循环，管内封装可以使胰岛与血流紧密接触，快速交换葡萄糖和胰岛素，因此可以快速控制血糖水平。这种封装方法会带来一些风险，例如静脉吻合处的血栓形成、感染和原发性或继发性内膜增生等。

1.2 宏封装：宏封装或微封装的分类取决于胶囊中封装胰岛的数量，宏封装指将大量胰岛封装在一起，血宏封装体中胰岛易聚集成大团块，导致核心坏死，营养和气体扩散有限，而且封装结构薄弱，在植入过程中容易破裂［17］。此外，这种封装的一个固有缺点是宏封装体的比表面积较小，不利于物质扩散。

1.3 纳米封装：纳米封装或保形涂层是一种新兴的封装技术，通过界面聚合在胰岛表面形成一层水凝胶薄膜［18-19］。纳米封装的主要限制是临床应用的困难。这种方法无法控制单个纳米封装胰岛的位置，因此难以取回或移除移植的胰岛［20］。而且纳米封装过程中部分涂层可能不完整而使胰岛暴露，进而触发宿主的免疫反应［21］。不仅如此，纳米封装过程中常使用有毒化学试剂和紫外线，可能导致细胞毒性而影响胰岛活性［22-23］。

1.4 微封装：微封装是指将少数单个胰岛 （通常＜3 个）封装在选择性渗透的微球中。微封装可能是糖尿病患者胰岛移植的首选方法，因为微胶囊提供了较大的比表面积，有助于快速交换营养物质和激素［24］。微囊化的原理是使用合适的聚合物将单个胰岛包裹成微胶囊。用于微胶囊化的聚合物不应影响内部的细胞和组织的活力和功能。此外，它既要足够柔软以适应体内软组织环境，还要足够强韧以避免破裂，同时还要允许营养物质扩散到胶囊中，治疗性激素（胰岛素）从胶囊中扩散出来。由于水凝胶的柔性和可调性，包括海藻酸盐、琼脂糖、聚乙二醇、丙烯腈共聚物和壳聚糖在内的多种水凝胶已被用于开发微胶囊封装技术［25］。截至目前，最理想的微胶囊封装材料是海藻酸盐，它的水溶液在与二价阳离子交联时发生凝胶化，进而形成刚性微球。海藻酸盐水凝胶的孔隙率和机械性能在一定范围内可调控，主要取决于海藻酸盐多糖链中2 种单元的比例、海藻酸盐的浓度、二价阳离子的选择和浓度［26］。

1.4.1 微封装发展的过程：最初的微胶囊封装技术是将含有胰岛的藻酸盐溶液挤出成液滴，进入含有二价阳离子交联剂（氯化钙）的溶液发生交联形成水凝胶微胶囊［27］。在之后的研究中，这种微胶囊化技术不断改进以获得胰岛微胶囊的所需特性，例如调整针头尺寸，采用同轴气流或电场提供剪切力，调控溶液流速和气流压力等［28-30］。目前，微流控技术已被用于微胶囊封装胰岛，这项技术有利于高通量生成尺寸均一的微胶囊［31-32］。海藻酸盐微胶囊的免疫隔离性能取决于用于微胶囊化的海藻酸盐水凝胶的分子渗透性，而后者又取决于水凝胶本身的孔隙特征和所涉及分子的生物化学特征，例如分子的大小、形状、分子量和带电基团等。海藻酸盐水凝胶的孔径范围为5 ～ 200 nm，由前述的4 个参数所决定［33］。这种孔径范围一般允许小于650 kDa 的分子通过，包括氧气、二氧化碳、尿素、葡萄糖、胰岛素和其他大分子。不同研究报道的截留分子量有较大差别，因此，海藻酸盐水凝胶的孔隙率需要适当调整以实现免疫隔离［34-35］。

1.4.2 微封装半透膜的选择：聚阳离子如聚-L-赖氨酸或壳聚糖作为性质不同的另一种半透膜包被海藻酸盐水凝胶微胶囊可为封装细胞提供免疫隔离［36-39］。为了避免聚阳离子涂层引起免疫反应，需要在其外面再包被第二层海藻酸盐，由此构成海藻酸盐-PLL/PLO-海藻酸盐微胶囊。尽管迄今为止的临床前大型动物模型研究和临床试验都显示了封装胰岛具有正常功能，但其长期存活率和功能仍存在问题［24，40-42］。这项技术已经研究和评估了近35 年，但市场上还没有任何相关的临床治疗产品。微胶囊封装技术在临床上面临的主要问题是胰岛功能的改变和宿主的免疫反应。

1.4.3 微封装存在的问题：移植的封装胰岛受到聚合物的保护可以免受宿主免疫系统的攻击，然而目前常用的封装材料本身却成为宿主免疫系统的目标。实际上异物反应发生在几乎所有常用的植入材料上，纤维化组织会沉积在植入物上形成致密的无血管胶原层。这层纤维化囊会影响氧气和营养物质等的扩散，危及封装胰岛的存活，同时也会阻碍植入物实现治疗功能的葡萄糖/胰岛素运输。而且材料表面吸附蛋白，还会引发免疫反应、补体激活等严重的生物反应。而对于目前封装胰岛最常用的海藻酸盐材料，其微胶囊内钙盐的不断积累和沉淀也会导致微胶囊内胰岛细胞失去功能［38］。另外，生理环境中大量存在的单价阳离子（如钠离子）不可避免的会置换作为交联剂的钙离子而导致微胶囊溶胀，使微胶囊封装结构失效。综上，开发免疫隔离效应高，供氧充足，免疫原性低的微胶囊依然任重道远。

2 新型微胶囊技术

2.1 微囊化胰岛、网袋结合的胰岛移植新方法：微囊化胰岛移植作为一种有前景的治疗1 型糖尿病的方法被广泛研究。微囊化胰岛移植部位的炎症反应导致胰岛早期功能障碍，移植部位周围缺乏血管导致营养不良和缺氧，难以切除胰岛。研究人员提出了一种将间充质干细胞与重组肽片、微囊化胰岛和网袋相结合的新型胰岛移植方法，该技术通过细胞网袋形式增强间充质干细胞的血管诱导效应，并通过共移植增强胰岛移植的效果。研究通过结合微囊化的胰岛、MSC-细胞网袋和包覆它们并使其能够去除的网袋，对糖尿病小鼠进行胰岛移植，治疗血糖效果显著增加。间充质干细胞与重组肽片、微囊化胰岛和网袋相结合的新型胰岛移植技术可以增强胰岛移植的效果［43］。

2.2 微胶囊内血管化研究新进展：目前临床胰岛移植的疗效受到长期移植功能障碍和损耗的限制，血管化是解决途径之一。Mao 等［44］探究丝质纤维素大孔（SF）支架在糖尿病小鼠中进行同种异体胰岛移植的血管化的潜力。该研究使用含有肝素的SF 支架（H-SF），在糖尿病小鼠的附睾脂肪垫中与H-SF 或SF 支架共同移植胰岛。结果表明H-SF-胰岛联合移植导致高血糖的更快逆转糖尿病，葡萄糖反应性完全正常化，长期血糖水平更低。移植结果显示H-SF 促进的胰岛血管重塑和细胞增殖，因为从H-SF-胰岛联合移植小鼠的移植物中显示出胰岛内分泌和内皮细胞增殖明显增加，伴随着血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的上调，小鼠出现明显的血管重塑。此外，当H-SF 与从VEGFR2-LUC 转基因小鼠体内提取的胰岛共同移植时，收集到与VEGFR2 表达相对应的生物发光信号的持续升高，这意味着肝素依赖性激活内源性VEGF/VEGFR2 途径在促进小鼠血管重塑和增殖中的作用［44］。Bowers 等［45］用聚3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸与聚己内酯混合以获得机械稳定性并电纺成纳米纤维，移植2 周后局部释放鞘氨醇-1-磷酸受体激活信号小分子FTY720 能够协调局部的再生环境，具有免疫调节和促进血管生成的作用。

2.3 微胶囊免疫排斥降低方式新进展：细胞外基质的不断优化和微囊膜涂层的不断优化，是研究者们不断优化微囊免疫排斥的新途径。Chaimov 等［46］利用猪胰腺的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）制造微胶囊，将液化后的ECM 与海藻酸盐结合，胶囊涂覆聚L-赖氨酸。结果显示，ECM 包裹的细胞被证明是无免疫原性的，最重要的是，它能显著改善糖尿病小鼠临床前模型的血糖控制，从而为这种新的基于细胞的胰岛素输送平台建立了概念验证［45］。Fukuda 等［47］建立了一种细胞涂层技术，使细胞表面能够被逐层（layer-by-layer，LbL）组装的细胞外基质所覆盖。LbL 涂层的细胞可以构建结构良好、密度大的球状体。功能分析表明，与无涂层细胞的球状体相比，有LbL 涂层细胞的球状体具有更强的胰岛素分泌能力，胰岛素和葡萄糖转运体2 基因的表达增加，缝隙连接分子connexin 36 的表达上调，葡萄糖敏感性明显改善。这种细胞涂层技术为制造胰腺β 细胞球状体提供了一种新的优化选择［46］。

2.4 扩大生成规模新研究：生物治疗的均质性是微囊化移植的成功因素之一，可以减少细胞抗原的暴露，均衡减少免疫反应，保证胰岛封装率。由于在微流控设备上可进行无限制的设计，因此有无数种方法来优化封装过程。近期被广泛研究的方向之一是扩大胶囊生产。一项研究表明，有8 个出口的微流控装置与其他方法相比，胰岛包封率更高［47］。在临床试验中，人类的移植每公斤体重大约需要10000 个IEQs，胰岛的封装率对维持胰岛的生存能力也至关重要。当胰岛被封装时，已经封装的胰岛必须在等待时间内进行培养或保存，这个过程不便于临床实施并且可能导致胰岛死亡。使用微流控的方法可以在更短的时间内增加封装的胰岛的数量，以便扩大规模，同时还可以不增加胰岛的流速或剪切应力。Onoe 等［48］利用双同轴微流控系统，将大鼠胰岛封装在由胰岛胶原核和藻酸琼脂糖壳制成的核心-壳水凝胶微纤维中。用微导管植入糖尿病小鼠的肾囊空间，结果显示移植后的大鼠血糖正常超过36 d。

3 微囊化胰岛移植的展望

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是我国发病率较高的慢性进展性疾病，胰岛移植可有效治疗糖尿病［49-51］。胰岛的封装在过去的几十年里有了很大的进步。但胰岛移植要想成为一种可行的治疗标准，就必须提供长期的治疗效果。虽然微囊化胰岛还在进行临床试验，但多年来还没有一项试验显示患者的血糖水平得到了良好的控制。减轻移植后缺氧的方法也可以用来减少细胞死亡，血管化可以减少细胞死亡，增加血浆胰岛素浓度。研究人员需要继续致力于改进包封技术，以减少免疫反应和提高细胞活力。不断寻找制备优质材料改进胰岛移植的效率，另外，如果胰岛可以大规模生产和封装，胰岛移植的成本将会减少，以上因素的不断优化将有望使微囊化移植成为糖尿病患者安全、有效、经济的治疗方法。