液相色谱串联质谱法测定鸡蛋、牛奶和羊奶中泰乐菌素A残留的研究

赵晨浩，杨 洁，孟 蕾，李慧素，彭 丽，张盼盼，刘婷婷，吴志明*

(1.河南农业大学动物医学院，郑州 450002；2.河南省兽药饲料监察所，郑州 450008)

泰乐菌素(Tylosin)亦称泰农霉素、泰乐霉素，是美国于1959年从弗氏链霉菌的培养液中提取获得的一种大环内酯类畜禽专用抗生素，主要由泰乐菌素A、B、C、D四个组分组成，除泰乐菌素D组分基本无抗菌活性外，A、B、C三个组分均有抗菌活性，且A组分抗菌活性最高，约占80～95%[1]。泰乐菌素在兽医临床上主要用于治疗由革兰氏阳性菌、支原体等引起的感染性动物疾病，使用不当易造成动物组织中该药物残留；若食用了泰乐菌素残留超标的动物组织，可引起人体胃肠道的不良反应，损害耳蜗神经，甚至造成肝肾损伤[2-3]。我国GB31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》[4]、国际食品法典委员会(CAC)、欧洲药品管理局(EMA)、美国食品药物管理局(FDA)和日本等均对泰乐菌素制订有最大残留限量(Maximum residue Limit，MRL)，且均规定泰乐菌素的残留标志物为泰乐菌素A，其中我国规定泰乐菌素在牛奶中的MRL为100 μg/kg，在鸡蛋中的MRL为300 μg/kg。

目前，国内外报道泰乐菌素残留检测的方法主要有FTIR光谱结合化学计量法[5]、微生物效价法[6]、胶体金检测法[7]、酶联免疫法[8-9]、高效液相色谱法[10-12]、液相色谱串联质谱法[13-14]等，但研究对象主要是畜禽的肌肉[15]、肝脏组织[11]，而禽蛋、牛羊奶中泰乐菌素A残留检测方法的报道甚少[16-18]。本文通过对仪器分析条件、提取及净化条件、固相萃取小柱、流动相等条件的优化，建立了鸡蛋及牛羊奶中泰乐菌素A残留测定液相色谱串联质谱法，可为全面监控泰乐菌素残留提供技术支撑，为动物源性食品质量安全提供保障。

1 材料与方法

1.1 仪器 液相色谱串联质谱仪(美国Waters公司，Xevo TQ-S)；高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；IKA MS3 basic漩涡仪(艾卡广州仪器设备有限公司IKA中国)；Milli-QA10 超纯水仪(美国Milipore 公司)；TTL-DCⅡ型氮吹仪(美国Organomation Associates公司)；固相萃取装置(美国Waters公司)。

1.2 试剂与材料 泰乐菌素A对照品(含量：98.0%)和泰乐菌素A-d3(含量：99.58%)均购自加拿大TRC公司；甲醇(色谱纯)和乙腈(色谱纯)均购自德国Merck公司；Oasis Prime HLB固相萃取柱(6cc，200 mg)购自美国Waters公司；试验用水为经 Milli-Q净化系统(美国 Millipore 公司)制备的去离子水。

1.3 溶液的配制

1.3.1 1 mg/mL泰乐菌素A标准储备液 精密称取泰乐菌素A对照品约10 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成浓度为1 mg/mL的泰乐菌素A标准贮备液，于-20 ℃以下保存，有效期3个月。

1.3.2 10 μg/mL泰乐菌素A标准中间工作液 精密量取1.3.1项下溶液1 mL置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，制成浓度为10 μg/mL的泰乐菌素A标准中间工作液，有效期1个月。

1.3.3 1 mg/mL泰乐菌素A-d3内标储备液 精密称取泰乐菌素A-d3对照品约10 mg，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成浓度为1 mg/mL的泰乐菌素A-d3标准储备液，于-20 ℃以下保存，有效期3个月。

1.3.4 1 μg/mL泰乐菌素A-d3标准中间工作液精密量取1.3.3项下溶液0.1 mL，于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，配制成浓度为1 μg/mL的泰乐菌素A-d3标准中间工作液，有效期1个月。

1.3.5 50%甲醇水溶液 取甲醇50 mL，加水稀释至100 mL，混匀。

1.3.6 0.1%甲酸水 取甲酸1 mL，加水稀释至1000 mL，混匀。

1.4 仪器条件

1.4.1 液相色谱参考条件 色谱柱：NanoChrom ChromCore C18柱(100 mm×2.1 mm，粒径1.8 μm)；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL；柱温：40 ℃。梯度洗脱，见表1。

表1 流动相梯度洗脱

1.4.2 质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源；正离子扫描(ESI+)；多反应监测(MRM)；电离电压：1.0 kV；源温：150 ℃；雾化温度：500 ℃；锥孔气流速：150 L/h；雾化气流速：1000 L/h；离子对、锥孔电压及对应的碰撞能量参考值见表2。

表2 定性定量离子对及对应锥孔电压和碰撞能量

1.5 试验方法

1.5.1 样品前处理 称取试料(2±0.01)g于50 mL离心管中，加入泰乐菌素A-d3(1 μg/mL)内标工作液100 μL，涡旋混匀静置15 min，加入乙腈10 mL，涡动10 s，涡旋振荡20 min，25 ℃10000 r/min离心10 min，取上清液，备用。取全部备用液过Prime HLB固相萃取小柱后，精密量取5 mL于40 ℃水浴氮气吹干，用50%甲醇水1 mL复溶，过微孔滤膜后，供液相色谱串联质谱仪测定。

1.5.2 标准曲线的绘制 精密量取适量标准中间工作液及内标标准中间工作液，用50%甲醇水溶液稀释成浓度为1、2、5、10、20、50、100 μg/mL的系列标准溶液(内标均为5 ng/mL)，从低浓度到高浓度依次进样，供液相色谱串联质谱测定。以待测物与内标物的定量离子色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

1.5.3 检测限与定量限的测定 按1.5.1项方法处理样品，再按1.4.1项条件进行分析测定。信噪比S/N≥3为检测限(Limit of detection，LOD)，S/N≥10为定量限(Limit of quantification，LOQ)。

1.5.4 精密度与准确度的测定 取空白鸡蛋及牛羊奶样品，以LOQ和MRL为依据，添加4个不同浓度(LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL)的泰乐菌素A标准溶液，按1.5.1项方法处理样品，再按1.4.1项条件进行分析测定，每个浓度5个平行样品，进行3次重复试验。求回收率和批内、批间变异系数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 在1～100 ng/mL的浓度范围内，泰乐菌素A色谱峰面积与浓度呈线性相关，回归方程为y=1329x±2698，r=0.9989，见图1。

图1 泰乐菌素A标准曲线图

2.2 检测限与定量限 按照信噪比S/N≥3为检测限，S/N≥10为定量限，求得鸡蛋及牛羊奶的检测限为2 ng/mL，定量限为5 ng/mL，色谱图见图2。

A： 泰乐菌素A标准溶液特征离子色谱图(2 ng/mL)；B： 泰乐菌素A标准溶液特征离子色谱图(5 ng/mL)；C： 空白鸡蛋基质空白特征离子色谱图；D： 鸡蛋空白添加试样特征离子色谱图(5 ng/mL)；E： 牛奶基质空白特征离子色谱图；F： 牛奶空白添加试样特征离子色谱图(5 ng/mL)；G： 羊奶基质空白特征离子色谱图；H： 羊奶空白添加试样特征离子色谱图(5 ng/mL)

2.3 精密度与准确度 从表3可以看出，鸡蛋样品中泰乐菌素A在5 ng/g～600 ng/g添加浓度范围内，平均回收率在90.1%～98.4%之间，批内、批间变异系数在2.7%～10.4%之间；牛奶样品中泰乐菌素A在5 ng/g～200 ng/g添加浓度范围内，平均回收率在86.3%～98.5%之间，批内、批间变异系数在4.3%～10.4%之间；羊奶样品中泰乐菌素A在5 ng/g～200 ng/g添加浓度范围内，平均回收率在86.9%～95.9%之间，批内、批间变异系数在4.1%～8.5%之间。

表3 空白鸡蛋、牛奶和羊奶中泰乐菌素A的添加回收率

3 讨论与小结

3.1 色谱条件的优化 通过比较大环内酯素类药物常用的甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水等流动相体系，发现甲醇-0.1%甲酸水作为流动相，出峰时间晚，响应值低，而采用乙腈-0.1%甲酸水作为流动相，可避免泰乐菌素A色谱峰展宽等问题，同时可获得对称、尖锐的峰形，因此选择乙腈-0.1%甲酸水作为流动相。

3.2 提取液的优化 提取溶液不仅影响药物的提取效率，同时也会对药物在固相萃取柱上的保留产生影响。本文根据文献分别对甲醇、80%乙腈和乙腈三种不同提取液进行考察[19-20]，结果发现，甲醇提取时，提取液浑浊，过柱容易堵塞；80%乙腈提取时，容易发生结块，且不容易过微孔滤膜；乙腈提取时，对药物有较好的溶解性和较强的去除蛋白质能力，能降低样品基质对分析测定的干扰，且平均回收率在80.1%～103.5%之间，因此选择乙腈作为提取液。

3.3 固相萃取柱的选择 根据相关文献分别考察了Waters Prime HLB、C18和Waters HLB等固相萃取柱的净化效果，结果发现C18柱和HLB柱二者也能较好的净化样品，但需要经过活化、淋洗、洗脱等繁琐的过程，不便于批量检测[21]；而Prime HLB柱净化时，省略了活化、淋洗、洗脱3步流程，操作简便，能更好地净化乳及乳制品中的蛋白质和磷脂等杂质[22]，且平均回收率在86.3%～98.5%之间，因此选择Prime HLB固相萃取柱净化。

本文建立了液相色谱串联质法测定鸡蛋及牛羊奶三种基质中泰乐菌素A的检测方法，其检测限为2 ng/mL，定量限为5 ng/mL，具有良好的重现性，准确度高，精密度好，前处理方法便捷，适用于鸡蛋及牛羊奶中泰乐菌素A残留的测定。