川续断皂苷乙对氟苯尼考在大鼠体内的药动学影响

王 斌，李思聪，梁 歌，李金良，张 敏，袁定胜，李旭廷

(动物遗传育种四川省重点实验室，四川省畜牧科学研究院，成都 610066)

氟苯尼考(Florfenicol，FFC)是畜禽专用的新型广谱抗菌药，本品通过抑制肽酰基转移酶活性而产生广谱抑菌作用，抗菌谱广，包括各种革兰氏阳性、阴性菌和支原体等[1]。本品口服吸收迅速，分布广泛，半衰期长，血药浓度高，血药维持时间长，在畜禽和水产动物的细菌性疾病防治中应用广泛[2]。川续断皂苷乙是一种重要的五环三萜齐墩果烷类皂苷化合物，具有很好的心血管保护、抗氧化、保肝、抗炎、抗肿瘤及免疫调节和抗骨质疏松等多种生物活性[3-4]，已从忍冬属植物山银花、灰毡毛忍冬、华南忍冬、水银花等发现该化合物的存在[5-6]。课题组开展了芍药苷、白头翁皂苷、甘草、黄芩苷等中兽药制剂及单体成分对氟苯尼考代谢的影响研究[7-9]，本文开展川续断皂苷乙在大鼠体内对氟苯尼考代谢的影响研究，进一步在基因和蛋白水平进行确证，探讨可能发生的药动学相互作用及其机制，从药物代谢酶角度为川续断皂苷乙的配伍规律提供实验依据，也为推动中西结合药动学发展提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 健康清洁级SD雄性大鼠，体重(200±20) g，由成都达硕实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK(川)2013-24。整个试验期间，于室温20～24 ℃下饲养，每天供给试验用SD大鼠专用饲料及纯化水，采血前12 h限饲。

1.1.2 主要试验仪器 UltiMate3000高效液相色谱仪，美国戴安公司产品；ZGDCY-48S水浴氮吹仪，上海梓桂仪器有限公司产品；CQ250超声洗涤器，上海超声仪器厂产品；800B台式离心机，上海安亭科学仪器厂产品；WH-3微型旋涡混合仪，上海泸西分析仪器厂产品；MiniSpin Plus 个人型高速离心机，德国艾本德公司产品；StepOne型荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司产品。

1.1.3 药品与试剂 川续断皂苷乙(CAS Number：33289-85-9，含量99.82%)，中国食品药品检定研究院；氟苯尼考对照品(编号K0301703，含量为99.1%)，中国兽医药品监察所产品；氯霉素标准品(批号130555-201704)，中国药品生物制品检定所产品；氟苯尼考原料药(批号202012125，纯度为98.9%)，浙江康牧药业有限公司产品；甲醇、乙腈(色谱纯)，艾万拓化工产品贸易(上海)有限公司产品；乙酸乙酯等其余试剂均为分析纯，成都科龙化工试剂厂产品。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药方法 24只健康大鼠随机分为2组，每组12只。试验组连续7 d每天灌服川续断皂苷乙，根据《中国药典》2015年版山银花人的临床剂量,计算实验大鼠临床剂量约为1. 35 g/kg，根据药典规定山银花中川续断皂苷乙的含量5%计算试验大鼠川续断皂苷乙的用量约为60 mg/kg, 1 次/d，空白组则给予相应体积的生理盐水，禁食12 h后于第8天，氟苯尼考按剂量30 mg/kg(氟苯尼考原粉溶于10%PEG-400配制成1%溶液)分别灌服2个组的各6只大鼠，并于给药后0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h断尾采集血液约0.1 mL，EDTA抗凝，4000 r/min离心5 min，分离血浆，置-20 ℃冰箱中保存待用。两个组剩余各6只大鼠于第8天乙醚麻醉后放血处死，分离肝脏和空肠组织用冰生理盐水漂洗滤干后冻存。

1.2.2 样品的处理 精确取血浆0.1 mL于试管中，加入10 μL氯霉素内标液(500 μg/mL)和400 μL乙酸乙酯，涡动混合2 min，4000 r/min离心10 min，吸取上层液于另一离心管中，然后再加入乙酸乙酯400 μL重复提取1次，合并两次提取液。在40 ℃水浴中氮气吹干，残渣加入200 μL流动相溶解，涡动混合2 min，12000 r/min离心10 min，将上清液转移至进样瓶，取20 μL进样检测。

1.2.3 标准曲线的制备 取空白血浆180 μL，加入20 μL氟苯尼考系列标准溶液，配制成50、20、10、5.0、2.5、0.5、0.1、0.05 μg/mL系列标准血浆样品，按1.2.2项下方法处理样品，以氟苯尼考与氯霉素峰面积的比值对相应氟苯尼考浓度作线性回归，求回归方程和相关系数。

1.2.4 色谱条件 色谱柱：Agilen HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(27∶73，V/V)；流速1.0 mL/min；检测波长223 nm；柱温40 ℃；进样量20 μL。

1.2.5 分析方法质量控制 以血浆样品高、中、低(0. 1、2. 5、20 μg/mL)3个浓度氟苯尼考考察方法的提取回收率和精密度，每个样品做5个重复。

1.2.6 RT-PCR检测大鼠肝脏CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1 mRNA表达量 取100 mg组织用组织破碎仪进行破碎，按照说明书用Trizol法提取组织总RNA。测定样品OD260 nm/OD280 nm比值，确定RNA浓度和纯度，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA，利用premier5.0软件设计大鼠CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1和看家基因β-actin引物序列(由上海生工生物公司合成)。实时荧光定量PCR检测上述基因mRNA转录水平，PCR反应体系20 μL：cDNA 模板2 μL；上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL；SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL；ddH2O 7.2 μL。反应程序如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，55～61 ℃退火15 s；72 ℃延伸20 s，共45个循环；60 ℃延伸1 min。结果采用相对定量分析，用ΔCt法计算基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.2.7 大鼠肝脏CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1和P-糖蛋白表达的测定 称取0.1 g 肝脏组织，加入1 mL组织蛋白抽提试剂，研磨后冰上孵育20 min，于10000×g 离心15 min 提取蛋白，用BCA 法测定蛋白含量。每组蛋白上样量为50 μg，120 V 恒压电泳90 min。采用半干电转，450 mA，100 min。用含5%脱脂奶粉和1%BSA的TBST封闭液，4 ℃封闭过夜，加入稀释后的CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1和P-糖蛋白一抗及GADPH 抗体(1∶500)，4 ℃过夜，用TBST 在室温下脱色摇床洗3 次。洗膜后加入量稀释的二抗(1∶10000)，于室温孵育50 min，用TBST 室温脱色摇床洗3 次，进行化学发光反应。

2 结果与分析

2.1 线性结果 以氟苯尼考与氯霉素峰面积的比值对相应氟苯尼考浓度作线性回归，得出氟苯尼考在质量浓度为0.05～50 μg/mL的范围内线性关系良好，回归方程为y=0.0309x+0.0078，相关系数R2=0.999。标准曲线见图1。

图1 血浆药物浓度标准曲线

2.2 方法回收率和精密度 测得方法回收率分别为(83.2±1.6)%、(84.1±2.3)%和(83.5±2.2)%，测得日内RSD分别为4.6%、2.3%和6.1%，测定日间RSD分别为4.5%、2.1%和6.2%。按信噪比S/N=3计算，最低检测限为0.02 μg/mL。

2.3 药动学参数 试验组和对照组大鼠均按单剂量(30 mg/kg)给予氟苯尼考后，测定不同时间点的氟苯尼考血药浓度，其血药浓度-时间曲线见图2所示，药动学参数见表2，结果表明，试验组AUC(0-∞)为34.468±3.346 mg/L·h，与对照组25.764±3.967 mg/L·h相比显著增加(P<0.05)，平均驻留时间MRT0-∞为4.308±1.206 h，与对照组3.019±0.550相比显著增加(P<0.05)；半衰期T1/2为3.208±0.860 h，与对照组1.824±0.266 h相比显著增加(P<0.05)，达峰浓度(Cmax)为10.144±1.538 mg/L，与对照组7.358±1.158 mg/L相比显著增加(P<0.05)，对照组清除率CL为0.759±0.192 L/h·kg，与对照组1.190±0.199 L/h·kg相比显著降低(P<0.05)。达峰时间Tmax和表观分布容积(Vd)，试验组和对照组之间差异不显著。

图2 试验组和对照组在大鼠体内的氟苯尼考(30 mg/kg)的血药浓度-时间曲线

表2 试验组和对照组在大鼠体内的氟苯尼考(30 mg/kg)药动学参数

2.4 川续断皂苷乙对大鼠肝脏CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1和空肠CYP3A1、MDR1 的mRNA表达影响 如图3(A)可知，试验组肝脏CYP1A2和CYP2C11 mRNA表达水平与对照组相比，分别降低68.8%和55.0%(P<0.05)，CYP3A1和MDR1 与对照组相比差异不显著(P>0.05)。由图3(B)可知，试验组空肠MDR1 mRNA表达水平与对照组相比，降低43.2%(P<0.05)，CYP3A1与对照组相比差异不显著(P>0.05)。

图3 大鼠口服川续断皂苷乙对肝脏(A)中CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1和空肠(B)中CYP3A1、MDR1 mRNA表达的影响 (n=6)

2.5 川续断皂苷乙对大鼠肝脏CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、P-gp和空肠CYP3A1、P-gp蛋白表达的影响 由图4(A)和图4(B)可知，试验组肝脏中CYP1A2和CYP2C11蛋白表达量与对照组相比分别降低38.71%和26.64%(P<0. 05)，CYP3A1、P-gp差异不显著；由图5(A)和图5(B)可知，空肠中P-gp表达量与对照组相比下降50.93%(P<0.05)，CYP3A1也降低，但差异不显著(P>0.05)。

图4 川续断皂苷乙对肝脏中CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、P-gp蛋白表达的影响 (n=6)

图5 大鼠口服川续断皂苷乙对空肠中CYP3A1和P-gp蛋白表达的影响 (n=6)

3 讨 论

药物的相互作用(drug-drug interaction, DDI)指在一定时间内先后服用两种或两种以上药物后所产生的复合效应，其中，代谢性药物的药物相互作用发生率最高，约占药代动力学相互作用的40%，可引起疗效增强甚至产生不良反应，或疗效减弱甚至治疗失败[10]。本试验采用川续断皂苷乙(60 mg/kg)连续大鼠灌胃7 d，给予氟苯尼考，试验组的联用后Cmax值与对照组相比显著增加(P<0.05)，Tmax与对照组之间差异不显著，表明川续断皂苷乙增加了氟苯尼考在大鼠体内的吸收程度，但对吸收速度无明显影响。同时，药物代谢过程中也发生了相互作用，川续断皂苷乙与氟苯尼考联用后，MRT0-∞和T1/2与对照组相比显著增加，CL与对照组相比显著降低(P<0.05)，表明川续断皂苷乙延缓了氟苯尼考在大鼠体内的代谢速度，降低了氟苯尼考的清除速率，AUC0-∞显著增加，是由于氟苯尼考的吸收程度增加，代谢减慢共同导致。

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和细胞色素P450酶系介导的药物相互作用，是中西药联用发生药动学相互作用最主要的因素，也是最常见的原因。P-糖蛋白可把其底物药物从肠上皮细胞主动转运回肠腔，使药物吸收减少，生物利用度降低[11]。细胞色素P450酶系受到诱导或抑制，会影响药物在动物体内的代谢，造成药效学的改变[10]。川续断皂苷乙是一种重要的五环三萜齐墩果烷类皂苷化合物，已有研究表明，类似三萜结构的中药单体对人和动物的药物代谢酶和转运酶有不同程度的影响。如萨础拉等[12]采用大鼠外翻肠囊模型研究了三七皂苷有效组分中人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1，发现其具有明显的P-gp底物转运特性并可竞争性抑制P-gp底物外排。Liu R[13]等研究发现，三七总皂苷可下调CYP1A2蛋白的表达，柴胡皂苷处理后的肝细胞，能够明显诱导CYP1A2的mRNA表达和增强CYP1A2的活性[14]，人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1可以诱导CYP1A1 mRNA与蛋白水平的表达[15]。本研究中发现，川续断皂苷乙连续大鼠灌胃7 d，可抑制空肠中MDR1的mRNA表达量和P-糖蛋白的表达量，这可能是造成氟苯尼考药动学参数Cmax增加，引起氟苯尼考在肠道内的吸收程度增大的主要原因。同时，肝脏中CYP1A2和CYP2C11的mRNA表达水平(P<0.05)和相应的蛋白表达水平降低，可能是造成了氟苯尼考在大鼠体内的代谢减慢，引起药动学参数MRT0-∞和T1/2增加的主要原因。

绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙是山银花的主要成分，绿原酸对CYP450酶活性和P-gp活性影响的研究已有报道[16-17]，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙对CYP450酶及P-gp活性影响未见研究报道。山银花和金银花俗称银花，生产实践中两者常常并用、混用，很多兽用成方制剂，如银黄口服液、双黄连口服液、银翘散等，都含有银花成分，在兽医临床上配合氟苯尼考等抗菌药物治疗畜禽感染性疾病，取得较好的治疗效果。本试验开展川续断皂苷乙对氟苯尼考代谢的影响研究，对拓展川续断皂苷乙及山银花在畜牧健康养殖中应用具有现实意义。

综上所述，川续断皂苷乙连续灌胃一周对氟苯尼考在大鼠体内的吸收和代谢有一定的影响，加快了氟苯尼考在大鼠体内的吸收程度和减缓了代谢，提示临床上两者合用有潜在增效作用，但兽医临床两者药物同时使用的药效学结果有待进一步加以确证。氟苯尼考药代学的改变可能与川续断皂苷乙抑制了大鼠肝脏中CYP1A2和CYP2C11的表达以及空肠中P-gp的表达有关。本研究为川续断皂苷乙的临床应用及川产道地药材山银花的进一步开发提供了基础研究数据。