莲心碱对大鼠非酒精性脂肪肝组织的保护作用及机制研究

李俊雅 梁 晓

1.湘潭医卫职业技术学院,湖南 湘潭 411102；2.桂林医学院,广西 桂林 541199

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是排除酒精、感染之外出现肝脏脂肪过度堆积的一种肝脏疾病。NAFLD可逐渐发展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌，同时还可增加糖尿病和心血管疾病的罹患风险[1-2]。随着人们饮食结构和生活习惯的改变，肥胖及代谢综合征的流行，NAFLD已经成为一种全球性的疾病，发病率在世界范围内逐年上升，发病年龄年轻化，逐渐成为影响人类健康的最常见肝病之一[3]。目前，NAFLD的发病机制复杂，国内外学者大多认为NAFLD 发病主要与氧化应激、细胞过度凋亡和过度炎症反应密切相关。NAFLD可划归于中医的“胁痛”“积聚”“癥瘕痞块”等疾病范畴。近年来中医药治疗NAFLD的疗效日益受到重视。本研究通过观察莲心碱对NAFLD大鼠肝组织NF-κB、TNF-α表达的影响，探讨莲心碱防治NAFLD的可能作用途径，为治疗NAFLD筛选有效药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠48只，体重(180±20)g，购于中南大学湘雅医学院实验动物中心。动物合格证号：SCXK(湘)2019-0041。

1.2 试剂与仪器 全自动生化分析仪(美国亚培公司)，Alpha Imager 2200型凝胶成像分析系统(美国Alpha公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；电子分析天平(德国Sartarius公司)；HH-2型恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；高速离心机(德国Eppndorf 公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)；ELISA试剂盒、蛋白免疫印迹系统(美国BIO-Rad公司)；WD-9405B型水平摇床(北京市六一仪器厂)。

1.3 模型建立、分组及给药 造模：大鼠适应性喂养3天后，随机分出8只作为8周空白组(第8周处死)和8只12周空白组(第12周处死)，普通饲料喂养。其余大鼠均采用高脂饲料(基础饲料88%、胆固醇2%和猪油10%)喂养8周，随机选取8只，进行肝脏病理组织学检查以确定是否造模成功。

分组：造模成功后，将剩余24只模型大鼠随机分为NAFLD模型组、莲心碱低剂量组和高剂量组，每组8只，继续喂养高脂饲料至实验结束。

给药：空白组和模型组给予同等剂量的生理盐水，药物预处理12周后，禁食12 h，10%水合氯醛(3.0 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血约5 mL，取肝组织，-20 ℃保存备用。

1.4 血清生化指标检测 测定空腹血清谷草转氨酶(AST)，谷丙转氨酶(ALT)，总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)水平。血浆静置2 h后，3000 rpm/min，4 ℃离心10 min，取上清液进行检测。

1.5 病理学观察 取肝脏右叶中部距边缘，剪取0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm肝组织若干块，置于10%多聚甲醛液中固定24 h，梯度乙醇洗脱后，石蜡包埋，切片(约4 cm厚度)，使用苏木精-伊红染色(HE染色)，光镜下观察肝组织的细胞脂肪变、炎症细胞浸润和坏死程度等病理学形态。

1.6 Western Blot测定肝组织NF-κB、TNF-α蛋白表达 取各组肝组织20 μg，放入加有裂解液PIRA和蛋白抑制剂PMPF混合液的EP管中，充分裂解肝组织。每个样本取出20 μL蛋白液进行蛋白定量，按目标蛋白NF-κB及TNF-α浓度配制分离胶，电泳后转至PVDF膜，取出PVDF 膜，TBST冲洗3次，封闭结束后，将PVDF膜置于1∶1000稀释的一抗溶液中，4 ℃冰箱孵育过夜，TBST冲洗3次，加入1∶2000稀释的二抗溶液，室温摇床孵育1 h。等比例混合BeyoEclplus A、B液，均匀滴加在PVDF膜表面，包覆封装后放置于暗盒中，在暗室中显影曝光。显影30～70 s后用清水冲洗，定影2～3 min，漂洗干净，自然晾干。

2 结果

2.1 大鼠血清生物化学指标的检测结果 实验结果显示，模型组的血脂(TC、TG)和肝功能(ALT、AST)较同期空白组明显上升(P<0.01)，并且8周模型组和12周模型组差异显著，存在统计学意义(P<0.05)，证实高脂诱导的NAFLD模型成功致使大鼠肝细胞损伤，喂养时间越长，肝细胞损伤越严重。对比同期模型组，治疗组血清中的TC、TG和ALT、AST含量下降明显(P<0.01)，但仍高于正常空白组。莲心碱治疗能降低大鼠血脂、胆固醇和肝功能方面，高剂量组最为显著。具体见表1。

表1 大鼠血清生物化学指标的检测结果

2.2 大鼠肝脏病理结果 正常空白组肝小叶结构清晰，未见肝细胞脂肪变性及炎症细胞浸润，无明显的病理变化。模型组的肝细胞肿胀，表现出弥漫性脂肪变，内部可见数量不一、大小不等的脂滴分布，胞质出现空泡状改变，其中以中央静脉周围改变最明显。肝小叶内和汇管区被炎症细胞浸润，并且肝小叶内可观察到局灶性点或片状的坏死灶。莲心碱治疗组肝细胞小叶结构基本完整，但存在轻度水肿。与模型组相比，莲心碱治疗组肝细胞内的脂滴数量下降，炎症浸润、脂肪变性坏死程度均表现出明显改善，以高剂量组尤为明显。具体如图1所示。

A B C DA.正常组；B.模型组；C.莲心碱高剂量组；D.莲心碱低剂量组图1 各组肝脏病理切片图

2.3 肝组织NF-κB及NF-α蛋白表达 Western Blot检测NAFLD大鼠肝组织中NF-κB、TNF-α基因表达。相比空白组，模型组肝脏组织中NF-κB蛋白表达显著上升(P<0.01)，药物治疗后，NF-κB蛋白表达有所下降，高剂量组优于低剂量组(P<0.01)；药物干预后各组TNF-α表达均不同程度降低，莲心碱高剂量组与低剂量差异明显(P<0.01)，高剂量组显著优于低剂量组。具体见表2。

表2 各组大鼠肝组织中NE-kB、TNF-α表达比较

3 讨论

ALT、AST是存在于肝细胞浆内的细胞因子，是肝脏代谢和转运功能的常见指标，当肝细胞受损时，能够进入血清中，导致血清ALT、AST水平升高， 因此，血清ALT、AST水平的高低是肝损伤的测定指标[4-6]。本研究构建的模型大鼠血清ALT、AST 水平升高，肝脏指数升高，肝组织中 TG、TC 水平升高，说明成功构建了NAFLD大鼠模型。TNF- α是一种肝损伤早期出现的一种促炎因子，可以诱导Kupffer细胞合成大量的白介素，导致中性粒细胞聚集，引起肝脏炎症和损伤[7-8]。而 NF-κB是机体内调控促炎细胞因子(TNF-α等)的转录与合成的关键调控因子。所以，通过NF-κB信号通路调节机体免疫炎性反应，可以积极改善肥胖所致NAFLD。

莲心碱主要是从中药莲子心中提取分离得到的生物碱。莲在我国各地均有栽培，主产于湖北、浙江、江西、福建、湖南等地[9]。现代药理学研究[10]表明莲具有调脂减肥、降血糖、抗氧化、抗病毒、抑菌抗炎、抗焦虑和抗抑郁等作用。杨丹虹等[11]发现莲的提取物通过改善肝细胞脂变，可以拮抗高脂高糖所导致的NAFLD。史霄燕等[12]发现莲心碱能够明显抑制多种诱聚剂诱导的高脂血症患者，治疗高脂血症。范婷婷等[13-14]认为莲总生物碱能抑制前脂肪细胞3T3-L1的增殖，调节脂代谢紊乱，从而控制体重、预防肥胖的功效。

本实验采用高脂饮食构建NAFLD大鼠模型，12周高脂喂养后，发现大鼠肝组织TC、TG、ALT和AST水平和NF-κB、TNF-α表达及血清明显上升，肝脏病理学出现脂肪变化，炎症加重。本研究用不同剂量莲心碱对NAFLD大鼠模型进行干预，结果显示: 莲心碱尤其是高剂量组可能通过降低NF-κB、TNF-α的表达，减少炎症因子的释放，进而减少肝细胞损伤，显著降低血清ALT、AST 水平，对血清TC、TG水平也有一定程度的降低，肝脏病理学改变也显示肝小叶内脂肪变细胞减少、缩小及炎症、坏死细胞减少、消失。实验结果也表现出量效依赖性，但量效关系中最佳治疗剂量的确定以及药物的安全性尚需进一步研究。

综上所述，莲心碱能够减轻NAFLD大鼠肝组织损伤，其作用机制可能与抑制炎症反应有关，莲心碱可能是治疗NAFLD的有效药物。