益生菌咀嚼片辅料优化研究及其口感评价

◎ 李 泽，余银芳，马绍龙，闫景辉，钟地长，胡俊杰

（1.江西中医药大学 药学院，江西 南昌 330004；2.江中药业股份有限公司中药矫味（掩味）和感官评价关键技术重点实验室，江西 南昌 330004）

近年来，全世界对以健康的人体肠道微生物区系为目标的益生菌和合生元产品的开发产生了极大的兴趣[1-2]。益生菌（Probiotics）是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡，发挥有益作用的活性有益微生物的总称[3]。摄取益生菌被认为是平衡人体肠道微生物区系的有效策略，可以改善肠道健康，降低各种疾病的风险，如代谢综合征、皮肤炎症等[4-5]。而保证“一定数量”和“活的状态”的益生菌是益生菌制剂发挥功效的前提。为了提高益生菌的存活率，人们探索了各种措施，如筛选高耐受性菌株、包埋、添加多糖和寡糖等[6-8]。

咀嚼片由于携带、食用等方便，具有较好的市场前景，广泛应用于食品工业[9]。本试验以发酵乳杆菌菌粉为主要原料，添加适量辅料，通过单因素试验和正交试验，优选益生菌咀嚼片主要辅料，并采用成对偏爱检验法，与市售同类型产品口感对比测评。本试验旨在通过益生菌咀嚼片研制，为益生菌类制剂研究提供一定的理论和实践经验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）（中国科学院微生物研究所）；麦芽糖醇（浙江华康药业股份有限公司）；山梨糖醇（浙江华康药业股份有限公司）；赤藓糖醇（保龄宝生物股份有限公司）；低聚果糖（量子高科生物股份有限公司）；低聚木糖（易常青生物科技有限公司）；低聚半乳糖（量子高科生物股份有限公司）；柠檬酸（山东英轩实业）；苹果酸（万利来香化有限公司）；酒石酸（天津市大茂化学试剂厂）；脱脂乳粉（呼伦贝尔塞尚雀巢有限公司）；MRS培养基（青岛海博生物技术有限公司）；氯化钠（湖北西陇化工有限公司）。

1.2 仪器与设备

BSA822-CW型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；AquaLab TDL水分活度仪（美国DECAGON公司）；电热鼓风干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司）；BBS-V800型超净工作台（济南鑫贝西生物技术有限公司）；UV-1800紫外分光光度计（SHIMADZU CORPORATION）；单冲压片机（国药龙立科技有限公司）；MA160-1CN型水分测定仪（赛多利斯仪器系统有限公司）；ZQZY-85BN型振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司）；智能硬度仪（天津市贝斯特科技公司）；LDZF-50L-III型立式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；SAFE-1500LC型生物安全柜（力新仪器上海有限公司）；XW-80A型微型旋涡混合仪（上海沪西仪器厂有限公司）；Eppendorf移液枪（南京贝登医疗股份有限公司）；HN-08型拍打式无菌均质器（上海汉诺仪器有限公司）；梅特勒FiveEasy Plus pH计（梅特勒托利多仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 制备工艺流程

益生菌咀嚼片制备工艺流程如图1所示。

图1 益生菌咀嚼片工艺流程图

1.3.2 指标测定方法

（1）水分含量测定。水分含量按照《食品安全国家标准 食品中水分的测定》（GB 5009.3—2016）第一法（直接干燥法）测定。

（2）益生菌活菌数测定[10]。活菌数按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35—2016）测定。益生菌活菌存活率=压片后益生菌活菌数/压片前益生菌活菌数×100%。

（3）水活度测定[11]。水活度采用AquaLab TDL水分活度仪测定，平行测定3份，取平均值。

（4）吸湿率测定[12]。参照《中国药典》（2020年版）四部“9103药物引湿性试验指导原则”试验，平行测定3份，取平均值。吸湿率=物料增加质量/物料质量×100%。

1.3.3 主要辅料筛选

益生菌咀嚼片主要由发酵乳杆菌菌粉、填充辅料（糖醇类、益生元、酸味剂等）、黏合剂和润滑剂组成。

（1）糖醇类辅料种类及用量筛选。糖醇类辅料在配方中占比较高，经预试和文献查阅，糖醇类辅料不会抑制益生菌活菌数的生长，但糖醇类辅料水分、水活度及吸湿率对产品质量稳定性和活菌存活率影响较大。经预试，选择麦芽糖醇、赤藓糖醇、山梨糖醇、木糖醇和异麦芽酮糖醇5种糖醇类辅料进行单因素筛选试验。取5种辅料适量，测定其干燥前、干燥后水分、水活度，同时按1.3.2吸湿率测定方法测定吸湿率，平行测定3次。

（2）益生元种类及用量筛选。相对于益生菌，益生元则是近年来出现的食品概念[13]。益生元可以定义为不可消化的食物成分，可以选择性地刺激结肠中一种或多种细菌的生长和（或）活性，从而对宿主产生有益的影响。低聚糖与益生菌复合使用，能够更好地发挥效果。有文献报道，益生菌生长过程中，其光密度值的变化在一定程度上可作为益生菌的生长状况的代表量，而益生菌生长过程中会产酸，pH值的变化也可一定程度上反映益生菌的生长状况，pH值下降得越快，益生菌产酸越多，益生菌生长越好。选择益生元低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖和菊粉，按试验方法进行试验，测定其OD600值和pH值，筛选较优益生元。配制含葡萄糖的MRS基础培养基为对照，将MRS培养基中的葡萄糖分别用等质量浓度的益生元代替，将发酵乳杆菌菌粉按1%的接种量接入活化培养基中，37 ℃培养16 h，测其OD600和pH值，每4 h检测一次。

（3）酸味剂用量筛选。经预试，柠檬酸酸味温和，未有不良后味，因此选择柠檬酸为配方中的酸味剂。

在保证配方口感前提下，分别往配方中添加0%、0.5%、1.0%和1.5%，测其活菌数，考察配方中不同比例柠檬酸对益生菌咀嚼片活菌数的影响。1.3.4 正交试验设计

（1）评分指标测定方法。评分标准的选择以益生菌的活菌存活率和片剂的成型性为指标进行综合评分，评分标准如表1所示。

表1 正交试验设计评分标准表

（2）正交试验因素水平表的设计。对辅料麦芽糖醇、低聚半乳糖和柠檬酸，采用L9(34)正交试验设计，以益生菌活菌存活率、成型性为考察指标进行综合评分，确定配方最佳比例。因素水平设计见表2。

表2 L9(34)正交试验因素水平表

1.3.5 益生菌咀嚼片口感测评

益生菌咀嚼片口感测评采用口尝法与市售火爆同类型产品B进行对比测评。

2 结果与分析

2.1 填充辅料筛选研究

2.1.1 糖醇类辅料筛选结果

如表3所示，试验结果表明，干燥后糖醇水分大小对比结果为异麦芽酮糖醇＞木糖醇＞山梨糖醇＞赤藓糖醇＞麦芽糖醇；干燥后糖醇水活度大小对比结果为木糖醇＞赤藓糖醇＞山梨糖醇＞异麦芽糖醇＞麦芽糖醇；吸湿率对比结果为异麦芽酮糖醇＞木糖醇＞山梨糖醇＞麦芽糖醇＞木糖醇。综合分析，选择麦芽糖醇为糖醇类辅料填充剂，设计其配方占比梯度为55%、60%、65%。

表3 5种糖醇类辅料水分、水活度、吸湿率测定结果表（n=3）

2.1.2 益生元筛选结果

由图2、表4结果可知，益生元充当培养基碳源后，益生元对发酵乳杆菌菌粉的体外增值作用由大到小为低聚半乳糖＞低聚果糖＞低聚异麦芽糖＞菊粉＞低聚木糖。值得注意的是，低聚木糖充当碳源的组别，益生菌几乎未生长，可能是低聚木糖对发酵乳杆菌的增值效果较差。根据试验结果，选择低聚半乳糖为配方中益生元，设计其配方占比梯度为10%、15%、20%。

表4 益生元充当碳源时的OD600变化表

图2 益生元充当碳源时的pH值变化图

2.1.3 酸味剂用量筛选结果

由图3可知，随着柠檬酸比例的增加，活菌数不断减少，由此可见柠檬酸的用量对益生菌活菌数的影响很大。根据试验结果，选择柠檬酸配方比例为0.5%、1.0%、1.5%。

图3 不同比例柠檬酸对益生菌咀嚼片活菌数的影响图

2.1.4 正交试验结果分析

正交试验结果见表5，方差分析结果见表6。根据方差分析可知，柠檬酸添加量（B）对益生菌产品影响显著，各个因素对片剂活菌数的影响顺序如下：柠檬酸＞低聚果糖＞麦芽糖醇，结合直观分析得出最优配方为A3B1C3，即麦芽糖醇65%，柠檬酸0.5%，低聚半乳糖20%。

表5 正交试验设计及试验结果表

表6 方差分析表

2.2 口感对比评价

本试验采用成对偏爱检验法，与市售火爆同类型产品B进行口感对比测评，即评价员比较2个样品，品尝后指出更喜欢哪个样品。本次检验中，有自制样品A（编号623）和市售火爆同类型产品B（编号846），共有30名评价员参与评价。本次成对偏爱检验采取必选检验单，不允许无偏爱。评价的结果是20名偏爱A，10名评价员偏爱B。根据评价结果，查阅《食品感官评价》一书中的偏爱检验附表可看出，在显著性水平为5%时，样品差异显著的最小判断数为21[14]。实际的数值为20＜21，因此评价小组对A样品的偏爱没有超过对样品B的偏爱，即2个样品的偏爱程度没有显著性差异。

3 结论

本文菌种选择了发酵乳杆菌菌粉，通过活菌存活率、片子成型性及口感筛选出麦芽糖醇、低聚半乳糖、柠檬酸等作为益生菌咀嚼片的主要辅料，通过正交试验得出益生菌咀嚼片主要辅料最佳配方为低聚半乳糖20%，麦芽糖醇65%，柠檬酸0.5%，优化后的益生菌咀嚼片活菌存活率高、成型性好、口感好。辅料中添加了益生元低聚半乳糖，有选择性地提高了益生菌使用时间，让产品具有生物特效；其中柠檬酸的添加量直接影响了益生菌制剂的活菌数，之后的筛选过程可有选择性地降低柠檬酸的添加量或者使用柠檬酸钠等酸度调节剂来中和。

益生菌制剂也称益生素、促生素、生菌素、益菌素及微生态制剂等[15]。现在益生素作为一类重要的“功能食品”生产行业，是食品工业发展最快的行业之一，在全球食品行业中占据着越来越重要的地位，因此研究和开发益生菌制剂对振兴我国的食品工业具有重要的意义[16]。而辅料是制剂的物质基础，是制剂生产的必备材料，因此辅料性质的研究至关重要，本文研究了部分辅料对益生菌制剂活菌数的影响，为后期益生菌制剂的开发提供技术支持。