振动胁迫对双孢蘑菇活性氧代谢和抗氧化性能的影响

孙炳新 于官楚 任 浩 唐建新

沈阳农业大学 食品学院 辽宁 沈阳 110866

0 引言

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）又名白蘑菇或纽扣蘑菇，具有丰富的食用价值和药用价值[1-3]，是目前唯一全球性栽培的食用菌，产量占食用菌总量的30%，备受国内外消费者青睐[4-5]。双孢蘑菇主要以鲜食为主，然而因其具有呼吸旺盛、含水量高和易受机械损伤等特点，子实体在采后极易失水、开伞和褐变，给蘑菇的贮运带来了困难[6]。此外，在运输过程中车辆的振动频率约为2～5 Hz[7]，会使双孢蘑菇不断受到振动胁迫，加速了蘑菇褐变、损伤等品质劣变，严重影响双孢蘑菇的货架期和商品价值。

目前已有研究[8-14]表明，振动可对梨、蓝莓、猕猴桃、杏、苹果、蒜薹、桃等果蔬品质产生不同程度的损伤。许时星等[9]探究了不同振动时间处理对蓝莓果实品质和抗氧化活性的影响，发现振动对果蔬的损伤不是瞬时形成的，而是逐渐累积的。S.Chaiwong 等[15]分别在3, 4, 5 Hz 振动频率下对草莓进行了50, 150 s的振动试验。结果表明，草莓在5 Hz、150 s的振动水平下显示出更严重的擦伤和更大的电导率值。胡云峰等[13]发现振动处理后蒜薹的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量升高，诱导过氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase，APX）活性升高。

尽管国内外学者围绕果蔬贮运问题已展开大量的研究，然而振动胁迫对双孢蘑菇贮藏期间品质和采后生理相关的研究还未见报道。鉴于此，本实验研究了不同振动时间对双孢蘑菇贮藏期间的活性氧自由基、抗氧化物质、抗氧化酶活性、细胞膜透性及双孢蘑菇颜色的影响，旨在为双孢蘑菇物流保鲜技术的开发提供理论依据。

1 试验

1.1 材料与试剂

选择外表洁白、菌盖直径为3～4 cm、无损伤、无畸形、未开伞的新鲜双孢蘑菇为试验样品；BOPP（聚丙烯）托盒尺寸为223 mm×133 mm×40 mm；PA/PE（聚酰胺/聚乙烯）复合膜的厚度为 69.2 μm，透氧率为68.218 cm3/(m2·24 h·0.1 MPa)，CO2的 透 过 率 为 30.645 cm3/(m2·24 h·0.1 MPa)，透湿率为 5.55 g/(m2·24 h)。

O2-、H2O2、SOD和CAT 试剂盒，南京建成生物工程研究所；三氯乙酸、抗坏血酸、愈创木酚、2, 6-二氯靛酚，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；2-硫代巴比妥酸，分析纯，上海瑞永生物科技有限公司；邻苯二酚，分析纯，沈阳瑞丰精细化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

台式微量高速离心机，H1650-W/H1650W型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；高速低温离心机，CR21N型，日本日立集团；电导率仪，DDS-11A型，上海雷磁创益仪器仪表有限公司；紫外分光光度计，UV-1800型，日本岛津公司；水浴锅，HWS28型，上海一恒科技有限公司；酶标仪，Eon型，美国BioTek公司；色差仪，CM-2300d型，柯尼卡美能达；低温恒温培养箱，MIR-254-PC型，日本松下公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

试验样品分为3组，每组约为2 kg，装入泡沫箱中（尺寸：26 cm×13 cm×15 cm）。将样品置于模拟运输振动台，设定振动速率为180 r/min（3 Hz），振动时间分别为1 h和2 h，并以未经振动的双孢蘑菇作对照。振动结束后，取约120 g双孢蘑菇置于BOPP托盒中，用PA/PE复合膜封装（在薄膜中心位置做扎孔处理，孔径为0.5 mm）后放入3 ℃的低温培养箱中贮藏，每组样品处理设3个平行试验。

2）H2O2含量的测定：称取约0.1 g组织，加入1 mL丙酮，进行冰浴匀浆；4 ℃、12 000 r/min下离心10 min，取上清液，冰浴待测；向EP管中加入上清液与试剂，充分混匀，25 ℃、12 000 r/min下离心10 min，弃上清液，留沉淀；加入试剂溶解沉淀后混匀，12 000 r/min离心2 min，于415 nm处测定吸光度值。

1.3.3 总酚和类黄酮含量的测定

参照Zhou Y.H.等[16]的方法，称取2 g双孢蘑菇，加4 mL预冷的体积分数为1 %盐酸-甲醇溶液，冰浴匀浆后转移至25 mL试管，再加1 %盐酸-甲醇溶液至20 mL，于4 ℃避光提取1 h，期间多次振荡；然后在4 ℃、12 000 r/min下离心20 min，所得的上清液即为总酚和类黄酮提取液。用酶标仪分别测定所得样品在280 nm和325 nm处的吸光度值，结果以每克鲜重（fresh weight，FW）样品在波长280 nm和325 nm处吸光度值作为总酚和类黄酮的相对含量。

1.3.4 抗坏血酸含量的测定

参照K.K.Mishra等[17]的2，6-二氯靛酚法，配制L-抗坏血酸（L-ascorbic acid，AsA）标准溶液（质量浓度为0～100 μg/mL），绘制标准曲线。根据标准曲线方程y=0.003x-0.0028（R2=0.9965）计算出双孢蘑菇中AsA的含量。

1.3.5 SOD和CAT活性的测定

1）SOD活性的测定：称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液，进行冰浴匀浆；4 ℃、12 000 r/min下离心10 min，取上清液，冰浴待测；向EP管中加入上清液与试剂充分混匀，室温避光静置30 min后，于450 nm处测定吸光度值。

2）CAT活性的测定：称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液，进行冰浴匀浆；4 ℃、12 000 r/min下离心10 min，取上清液，冰浴待测；向EP管中加入上清液与试剂，混匀，室温25 ℃下反应5 min，取混合溶液加入试剂，混匀，室温25 ℃下反应5 min，于510 nm处测定吸光度值。

1.3.6 APX活性的测定

称取2 g双孢蘑菇，加入5 mL 0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH= 7.5，含质量分数为2 %的聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）），在冰浴条件下匀浆，于4 ℃、12 000 r/min下离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

活性测定：参照文献[18]中方法，以每克鲜重（FW）样品每分钟吸光度变化0.01为酶活力的1个单位（U/(min·g)）。

1.3.7 多酚氧化酶活性的测定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）提取方法同POD酶，参照文献[18]中方法，以每分钟吸光度变化1为酶活力的1个单位（U/(min·g)）。

1.3.8 MDA含量和相对电导率的测定

MDA含量采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法[19]测定。相对电导率测定：切取6片大小一致的双孢菇肉，用去离子水冲洗3次，加40 mL去离子水并振荡30 min，测定初始电导率（σ0），然后沸水浴10 min（透气过滤封口膜封口），冷却至室温后测电导率（σ1），则相对电导率（σ′）为

1.3.9 色泽

使用色差计测定双孢蘑菇菌盖的L*、a*、b*值。其中L*值反映双孢蘑菇的亮度，数值越大表示亮度越高；a*值反映双孢蘑菇的红绿度，正值代表偏红，负值代表偏绿；b*值反映双孢蘑菇的黄蓝度，正值代表偏黄，负值代表偏蓝。每组随机选取5个双孢蘑菇，在菌盖随机取3个点进行测定取平均值。以褐变指数（browning index，BI）表征蘑菇菌盖的颜色变化[20]：

调查中发现快递不快以及不予送货上门的问题十分突出。在北京市消协和市工商局12315指挥中心受理的快递投诉中约占3成多。客户选择物流公司的首要优势就是物流快速及时方便，然而一些快递公司允诺一两天内到达的货物往往要拖上几天。延误或者晚点会对于有些客户而言，可能会造成严重损失，影响客户体验。如北京市消费者张女士委托某快递公司快递户口本从临沭至北京，快递公司承诺3日内送到，但消费者等了8天也没收到。

其中

1.3.10 数据处理

使用IBM SPSS 20.0软件对数据进行方差分析，运用Duncan多重比较法对差异显著性（p＜ 0.05）进行比较分析，使用Origin 9.1软件对数据进行绘图。

2 结果与分析

2.1 振动胁迫对双孢蘑菇产生O2-活力和H2O2含量的影响

为了研究振动胁迫对双孢蘑菇品质的影响，将样品置于模拟运输振动台，振动时间分别为1, 2 h，并以未经振动的双孢蘑菇（简称CK）作为对照，经过一段时间后，双孢蘑菇产生活力和H2O2含量变化如图1所示，图中字母表示同一天内不同处理组之间的显著性（p＜ 0.05，下同）。

图1 振动胁迫对双孢蘑菇产生O2-活力和H2O2含量的影响Fig.1 Effects of vibration stress on production O2-activity and H2O2 content of Agaricus bisporus

2.2 振动胁迫对双孢蘑菇总酚和类黄酮含量的影响

酚类物质和类黄酮是双孢蘑菇中主要的抗氧化成分[22]，这些成分对人体预防癌症和心血管疾病等具有积极作用[23]。

模拟振动试验中，不同振动时间（1, 2 h）及未振动对照组双孢蘑菇在经过一段时间后，总酚和类黄酮的含量变化如图2所示。

图2 振动胁迫对双孢蘑菇总酚和类黄酮含量的影响Fig.2 Effects of vibration stress on total phenolic and flavonoid content of Agaricus bisporus

2.3 振动胁迫对双孢蘑菇AsA含量的影响

AsA作为植物体内重要的非酶类抗氧化物质，能够在逆境胁迫过程中清除植物体内过量的活性氧，保护细胞膜结构，并在一定程度上抵抗逆境胁迫，延缓果实衰老[21]。

模拟振动试验中，不同振动时间（1, 2 h）及未振动对照组双孢蘑菇在经过一段时间后，AsA含量变化如图3所示。

图3 振动胁迫对双孢蘑菇AsA含量的影响Fig.3 Effect of vibration stress on ascorbic acid content of Agaricus bisporus

由图3可知，双孢蘑菇的AsA含量在贮藏期内总体上呈下降趋势。新鲜双孢蘑菇的AsA含量为63.51μg/g，振动处理组蘑菇的AsA含量前4 d急剧下降，第4 d的AsA含量分别是初始值的87.59%（1 h）和84.37%（2 h），而对照组在前4 d下降不明显。这可能是因为振动胁迫加速了AsA分解，AsA氧化生成羰基化合物，与氨基酸、蛋白质等含氮化合物聚合生成有色物质，加速褐变[24]。由此推测，抗坏血酸氧化引起的非酶促褐变可能是导致双孢蘑菇褐变的主要因素之一。

2.4 振动胁迫对双孢蘑菇抗氧化酶和多酚氧化酶活性的影响

SOD酶、CAT酶和APX酶是抗氧化代谢中重要的活性氧清除酶，对细胞内氧化还原平衡起着重要的作用。通过清除组织和细胞中的O2-及其分解产生的H2O2，可减少膜的氧化损伤，达到延缓细胞衰老的目的[9]。PPO酶能催化O2与酚类物质反应，导致果蔬发生酶促褐变[25]。

模拟振动试验中，不同振动时间（1, 2 h）及未振动对照组双孢蘑菇在经过一段时间后，抗氧化酶（SOD酶、CAT酶和APX酶）和多酚氧化酶活性的变化如图4所示。

图4 振动胁迫对双孢蘑菇SOD酶、CAT酶、APX酶和PPO酶活性的影响Fig.4 Effects of vibration stress on SOD, CAT, APX and PPO activity of Agaricus bisporus

由图4a可知，在振动处理后的前4 d，振动组SOD酶的活性均显著高于对照组，且2 h振动组的要高于1 h振动组。SOD酶活性在振动胁迫后快速升高，并在第4 d达到峰值，分别为316.45 U/g FW（1 h）和325.54 U/g FW（2 h）。由图4b可知，CAT酶活性呈现先降低后升高的趋势，前4 d内CAT酶活性虽降低，但振动组仍高于对照组，4 d后对照组CAT酶活性显著升高，远超过振动组CAT酶活性。 由图4c可知，对照组蘑菇的APX酶活性在整个贮藏期间变化幅度较小，但普遍低于振动处理组；振动组APX酶活性分别在第4 d（2 h）和第6 d（1 h）达到峰值，随后活性下降。以上结果表明双孢蘑菇经历振动胁迫后会迅速启动自由基清除机制，以维持蘑菇活性氧代谢的平衡；随后活性氧清除能力从第4 d开始逐渐减弱，振动组双孢蘑菇的活性氧清除能力在后期低于对照组，导致蘑菇膜脂过氧化加速，加剧了细胞膜的氧化损伤。由图4d可知，总体上振动处理后蘑菇的PPO酶活性高于对照组，尤其是在贮藏前期，2 h振动处理组蘑菇的PPO活性显著提高。这是由于振动胁迫导致的机械损伤加速了酚类物质与PPO酶的反应，从而加速双孢蘑菇的褐变。在贮藏后期，可能由于酚类物质的大量消耗，2 h振动处理组蘑菇的PPO活性处于较低水平。

2.5 振动胁迫对双孢蘑菇MDA含量和相对电导率的影响

振动胁迫导致膜损伤的原因通常与活性氧（reactive oxygen species，ROS）的过量积累和膜脂过氧化密切相关。MDA作为多不饱和脂肪酸氧化的产物之一，能加剧细胞膜的损伤，且细胞膜透性与细胞膜的完整程度密切相关，因此MDA含量和相对电导率可间接反映细胞膜受损的程度[26]。

模拟振动试验中，不同振动时间（1, 2 h）及未振动对照组双孢蘑菇在经过一段时间后，MDA含量和相对电导率的变化如图5所示。

图5 振动胁迫对双孢蘑菇MDA含量和相对电导率的影响Fig.5 Effects of vibration stress on MDA content and relative electrical conductivity of Agaricus bisporus

由图5可以看出，蘑菇的MDA含量和相对电导率在贮藏期内均呈上升趋势，且振动处理组显著性高于对照组（p＜0.05），表明蘑菇在贮藏期内细胞膜的损伤随贮藏时间的延长而加剧，从而导致更多的电解质渗漏[27]，这是机械振动造成的典型生理损伤之一，在梨[28]、哈密瓜[29]、草莓[30]等果实的振动研究中也有类似报道。

2.6 振动胁迫对双孢蘑菇色泽的影响

色泽作为双孢蘑菇采后最直观的品质参数，是影响消费者购买行为的重要因素。褐变是振动胁迫后品质下降的主要表现之一，可由L*和BI来反映[31]。L*值越低双孢蘑菇颜色越暗，研究表明当双孢蘑菇的L*值大于80时，是消费者可接受的品质[32]。

模拟振动试验中，不同振动时间（1, 2 h）及未振动对照组双孢蘑菇在经过一段时间后，L*和BI的变化如图6所示。

图6 振动胁迫对双孢蘑菇L*和褐变指数的影响Fig.6 Effects of vibration stress on L* and browning index of Agaricus bisporus

由图6可知，振动处理后双孢蘑菇的亮度值显著低于对照组，BI值则显著高于对照组，表明双孢蘑菇的褐变程度随振动时间的延长而不断加剧，这可能与贮藏后期大量活性氧积累，较低的SOD酶、CAT酶活性以及较低的总酚、类黄酮和抗坏血酸含量相关，导致MDA含量和电导率不断升高，细胞氧化损伤严重，从而加速双孢蘑菇褐变。由此推断，抗氧化酶活性变化是导致双孢蘑菇褐变的主要原因[24]。

3 结论

振动胁迫对双孢蘑菇的色泽及抗氧化性能具有显著的影响，振动胁迫引发的氧化应激加速了总酚和类黄酮等抗氧化物质的产生，并诱导双孢蘑菇产生大量的活性氧自由基，伴随着膜脂过氧化作用逐渐加剧最终导致细胞的氧化损伤。此外，振动胁迫后双孢蘑菇通过提高抗氧化物酶活性迅速启动自由基清除机制，以维持蘑菇活性氧代谢的平衡。然而随着自由基的大量积累，在第4 d后双孢蘑菇的活性氧清除能力开始逐渐减弱，导致蘑菇膜脂过氧化加速，加剧了细胞膜的氧化损伤。

综合以上，振动胁迫条件下双孢蘑菇的活性氧自由基迅速积累，导致细胞膜的氧化损伤加剧，从而加速了双孢蘑菇的褐变。