不同动物饲料中晚期糖基化终产物

何 颖 译自Frontiers in Imunolgy,Vol.9(2018))

李 红 审 潘雪男 复审

1 牛奶和乳清蛋白粉中的晚期糖基化终产物

乳制品行业会在生产中产生大量的液态奶酪乳清，这些乳清加工后可以生产出各种乳清产品，包括浓缩乳清蛋白、分离乳清蛋白和多种单独的乳清蛋白。这些加工过的乳清产品可广泛用作动物饲料的添加剂，用于母猪和新生仔猪、幼龄反刍动物(犊牛)、狗、猫、家禽和水产动物的饲料。在养猪业，仔猪早期断奶已成为提高猪场生产效率和经济效益的常规做法。食物由母乳向固态饲料的突然转变，饲养环境的改变，都会给仔猪及其健康带来巨大的挑战。为了尽量减少由此产生的应激，越来越多的猪场会使用代乳料来稳定仔猪肠道微生物菌群，防止肠道发生功能性紊乱，从而提高仔猪的生长性能。牛奶由于含有均衡的营养成分而成为新生仔猪合适的饲料。作为奶酪制造行业的一种副产物，奶牛业甚至还将乳清蛋白喂给奶牛。目前已经应用的产品包括液态、固态或者浓缩乳清及其衍生物。此外，家禽业也在家禽饲料中添加乳糖和乳清粉。由于不能分泌乳糖酶，家禽并不能通过肠道完全吸收乳糖。相反，乳糖发酵会产生乳酸和挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)，这些产物能促使乳酸杆菌在鸡肠道中定植。肠道中高浓度的VFA被认为有益于家禽的健康，因为它们能够降低盲肠内环境的pH，并会改变氧化还原电位，两者联合作用能够抑制潜在病原菌的生长。因此，在日粮中添加乳清蛋白粉是提高肉鸡生产力的一种有效方法。

在热加工过程中，高温会使牛奶和其他乳制品中的乳清蛋白、糖发生糖基化，并产生晚期糖基化终产物(advanced glycation endproducts，AGEs)。在牛奶中，乳清蛋白是受热后最易被破坏的蛋白质，并且易发生糖基化。密集的加热已经被证实能够促进乳清发生美拉德反应，并形成相应的产物。在较低水活度(aw=0.23)条件下进行密集的干燥加热，乳清蛋白会出现聚集，并发生美拉德反应。此外，干燥加热不仅会促使乳清蛋白发生聚集，还会形成与可溶性晚期糖基化终产物(soluble receptor for advanced glycation endproducts,sRAGEs)结合的配体，后者会影响食品化合物的免疫原性。RAGEs被认为是与动物先天性免疫相关的一种模式识别受体，主要识别蛋白质构象(二级结构)，例如β-折叠和纤维样蛋白，而不是蛋白质的主要氨基酸序列(一级结构)。这表明加热可能会诱导蛋白质形成更多的β-折叠，促使乳清蛋白聚集，同时与sRAGEs结合。加热过程中蛋白质变性的影响对乳清蛋白而言是众所周知的。因此，研究这些AGEs修饰态蛋白和免疫细胞受体(作为一个重要的接触互作点)之间的互作似乎是值得的。

2 宠物食品中的AGEs

在大多数情况下，宠物(包括狗和猫)在其一生中会被喂给经过高度加工后的商业性宠物食品。这些食品的加工主要依赖于热处理(例如膨化、杀菌、干燥)，以提高营养物质的消化率、保质期和安全性。热处理后，宠物食品中的活性赖氨酸比例平均占总赖氨酸含量的73%(范围39%～100%)，而在生长期狗的日粮中添加的赖氨酸数量可能低于动物营养需要量的推荐值。因此，与长期食用这些加工食品的健康狗(对照组狗)相比，患糖尿病和肾功能损伤的狗。

用于配制宠物食品的原料和加工方法是影响终产品中美拉德反应产物(Maillard reaction products，MRPs)浓度的关键因素。平均而言，如果以干物质计，罐头食品中MRPs和AGEs的总浓度要高于颗粒食品和膨化食品中的。van Rooijen等研究发现，商业性宠物食品中N-羧甲基赖氨酸[N-(carboxymethyl) lysine，CML]和羟甲基 糠 醛 (hydroxymethylfurfural，HMF)的平均含量介于报道的人类加工食品中的含量范围。但是，狗和猫对HMF的平均日摄入量分别为成年人平均日摄入量的122倍和38倍，而对CML的平均日摄入量与成人的相当。该研究还强调了测定狗生长期断奶日粮中活性赖氨酸含量的重要性。

重要的问题仍然是在已报道的宠物食品中MRPs和AGEs的含量是否会影响动物的生理活动，这在一定程度上取决于这些MRPs的生物利用率。观察表明，随着猫增加采食量，其尿液中MRPs的浓度增加，这说明日粮中的MRPs被成年猫的胃肠道吸收，并随尿液排出。研究还发现，随着猫采食量增加，其泌尿功能恢复受阻，表明MRP是猫消化、吸收、代谢或者排尿的一个限制因素。到目前为止，还没有研究报道这种能被吸收的日粮MRPs是否会对宠物的健康产生长期的影响。

3 猪日粮中的AGEs

蛋白质是猪日粮中主要的营养物质，因此，了解动物对蛋白质的吸收和利用对养猪生产及行业的可持续发展具有重要意义。储存和加工，尤其是加工条件，在很大程度上决定了主要饲料原料的营养价值，这很可能取决于导致MRPs形成的加热过程中温度和湿度这两个参数的联合作用。饲料原料生产商常用多种不同加工方式处理猪日粮的原料(例如豆粕、干酒糟及其可溶性物、玉米、玉米蛋白粉)。在生产油籽原料(豆粕、菜籽粕、葵花籽粕和棉籽粕)时，通常需要采用热加工工艺来提高营养价值，以去除油脂提取过程中所使用的萃取剂。这些步骤包含了不同程度的热处理对蛋白质营养价值的影响，尤其是采用高温处理工艺时。正如上述所讨论的赖氨酸——猪日粮营养成分中第一限制性氨基酸——是美拉德反应(Maillard reaction，MR)中活性最大的氨基酸。因此，赖氨酸通常会被以晶体态的形式加入猪日粮中，以确保吸收的氨基酸和可用的氨基酸的平衡与蛋白质合成的需求完全一致，确保动物获得最佳生产性能。

4 牛饲料中的AGEs

奶牛场通常会定期给奶牛饲喂浓缩料，浓缩料含有热加工产生的MRP和AGEs，而这些化合物能在牛奶中被检测出。有机饲养的奶牛只喂给未经热加工的日粮，例如青草或青贮饲料。因此，有机牛奶含有较低水平的糖基化蛋白，其含量和组分能被检测。饲料中的MRP(如吡咯素)可以在血液净化时形成的尿液中被检测到，因此可以预测奶牛在哺乳期能够将AGEs分泌至牛奶中，随后哺乳给新生牛犊。在过去数十年中，奶牛的产奶量有了显著提高，与奶牛的天然食物原料相比，奶牛需要更高水平的能量和氮。因此，在奶牛生产中，奶牛场越来越多地给奶牛饲喂加工过的糖蜜、豆粕和菜籽粕，与此同时伴随着可能会提高奶牛摄入高水平MRP的风险。饲料中的MRP能够影响奶牛瘤胃中的微生物组成。此外，用来配制奶牛日粮的粗饲料往往具有很低的消化率，因此，为确保乳制品的生产率，奶牛场有必要给奶牛饲喂可以被吸收的含有MRP的浓缩饲料。使用水解和热诱导糖基化加工的牛奶蛋白表现出抗氧化和抗炎活性，从而提高其功能性。生的牛肉和猪肉天生含有一小部分的蛋白态AGEs(protein-bound AGEs)，而生的鸡胸脯肉含有更高水平的此类AGEs。因此，在牛肉中，蛋白含量不会显著影响蛋白态AGEs的总水平。商用加工方法将在很大程度上决定蛋白态AGEs的总含量。

5 AGEs和奶牛跛行

在世界各地的奶牛场，奶牛跛行(蹄叶炎)是最突出、最严重的动物健康和福利问题之一，该病主要由蹄部损伤或发生炎性病变造成。饲养地不同，奶牛的跛行发病率也不相同，通常介于2%～55%；但是，在过去20年中，奶牛的跛行发病率显著提高。奶牛跛行除了是生产中一个重要的福利问题之外，还是一个导致产奶量减少、繁殖率降低以及淘汰风险提高的重要的经济因素。蹄叶炎被定义为牛蹄的一种真皮弥散性、无菌性炎症，被认为是引发跛行的一个重要因素。有证据证明，与蹄叶炎相关的蹄损伤包括蹄底和白线出血以及蹄底溃疡被认为是引发奶牛跛行的重要因素。引发蹄叶炎的诱发因素很多，包括农场管理、牛舍条件、品种、育种和营养水平。尽管营养水平与蹄叶炎的发生有着广泛的联系，但日粮和/或饲养管理的特点以及这些特点如何导致跛行发生的机制尚未得到充分的研究。

同样，众所周知，马也会发生蹄叶炎，且肥胖和抗胰岛素作用是与蹄叶炎发生密切相关的因素。胰岛素的作用通过实验得到了证实，给临床上正常的马长期注射胰岛素和葡萄糖以使血糖含量维持在生理水平上，结果诱发了蹄叶炎。日粮含有AGEs表明其参与了胰岛素诱发蹄叶炎。同样，有人认为，日粮中的AGEs和抗胰岛素作用共同导致牛蹄叶炎。有研究表明，抗胰岛素作用通常出现在泌乳早期的奶牛中，如果大量采食快速发酵的碳水化合物或淀粉，这种情况可能会加剧。有趣的是，泌乳早期也是奶牛蹄叶损伤的高发阶段，例如常常观察到蹄底和白线出血。可以说，奶牛在泌乳早期发生蹄叶炎可能与抗胰岛素作用和AGEs的产生有关。

晚期糖基化终产物是由葡萄糖通过乙二醛、3-脱氧葡萄糖酮和甲基乙二醛等中间产物衍生而来的，有学者推测甲基乙二醛是细胞内和血清中AGEs的主要来源。研究表明，在体外环境中，乙二醛酶Ⅰ和乙二醛酶Ⅱ共同作用将甲基乙二醛转化为D-乳酸盐，从而阻止AGEs的形成。给牛和马饲喂大量的可发酵碳水化合物，会导致瘤胃或盲肠发生酸中毒，继而引发全身性酸中毒，牛血清中的D-乳酸盐水平可能会提高至25 mMol/L。不幸的是，终产物D-乳酸盐会对乙二醛酶Ⅰ产生负反馈，但是这可能与蹄叶炎的发生有关。除了AGEs可能来自动物中间代谢产生的甲基乙二酸外，甲基乙二酸也可以在快速发酵的碳水化合物进行厌氧发酵的过程中形成。前文已经提到，在生理条件下甲基乙二醇能够被转化成D-乳酸盐。因此，可以推测，在奶牛和马的实际饲喂条件下，快速发酵的碳水化合物在发酵时会导致D-乳酸盐和甲基乙二醇累积。甲基乙二醇对于细胞是有毒性的，最终会导致细胞裂解，随后释放出脂多糖，而这些脂多糖与牛和马的蹄叶炎有关。另外，甲基乙二醇可能会被牛和马的瘤胃上皮细胞吸收，并通过胃肠道上皮细胞随后激发AGEs的形成。

6 讨论

热加工会改变食品成分的化学和物理特性，例如加热会导致MRPs和AGEs产生。MR态蛋白质是在糖和加热的共同作用下产生的。这些分子在非均匀混合物中以不同形式存在，正是这些不同的存在形式证明它们具有不同的生物活性。

饲料的成分和配方以及饲料加工工艺决定了动物肠道的健康和对疾病的抵抗力。含有MRP和AGEs的蛋白质原料能够导致动物肠道微生物扩张，再与能够损伤肠道屏障的化合物聚集一起作用，损坏肠上皮细胞的屏障功能，激发机体的免疫应答反应，最终导致动物生长变缓、生产性能下降和疾病的暴发。

采用集约化方式饲养的动物常常会遭受免疫应激，连同病原体负载、饲养环境、饲料组成与生产工艺以及制定的免疫接种程序一起决定动物的免疫状态。炎症的发生可能与释放促炎性细胞因子、动员储备的营养物质、抑制肠道吸收营养物质以及因利尿和腹泻等导致体液流失有关，使动物付出巨大的营养代价。激活获得性免疫应答，产生特异性抗体，将会消耗相对较少的营养成本。因此，日粮中的免疫调节剂和/或疫苗将能够增强动物机体的免疫应答，减少免疫应激，促进机体的健康，提高生产性能。

日粮糖基化蛋白(dietary glycated proteins，dAGEs)具有免疫调节功能。大量的证据表明这些糖基化蛋白与动物的许多慢性疾病有关，这些慢性疾病主要由细胞和组织中AGEs调控蛋白的累积而引发。AGEs和APCs(包括巨噬细胞和树突状细胞)之间的相互作用可能是引发这种免疫刺激的潜在机制。这些细胞的细胞膜上的模式识别受体能够识别经过修饰的蛋白，形成复合物，并开始向细胞内转运，最终激活k 基因结合核因子(nuclear factor-k-gene binding，NF-kB)转录因子，产生促炎性细胞因子，并诱发氧化应激。此外，由于巨噬细胞和树突状细胞属于APCs，由处理后的抗原衍生出的多肽将被递呈至MHC-Ⅱ分子上的CD4+T细胞。递呈的抗原和分泌的细胞因子联合作用将激活T细胞，并诱发细胞反应，如果刺激持续存在或抑制机制不能有效解决平衡问题，就会产生慢性炎症状态。

由于美拉德反应产生的AGEs具有多样性，许多细胞受体对这些AGEs具有结合亲和力。在这些受体中，RAGEs是被讨论和研究最多的一个受体，sRAGEs是RAGEs的可溶性变体。存在于RAGEs上，而不是sRAGEs上的跨膜和细胞内信号域，对将信号传递至细胞核并激活NF-kB至关重要。由于sRAGEs仍然携带配体结合域(V结构域)，它对AGEs修饰的蛋白态具有与RAGEs本身相似的结合亲和力。在体内试验中，sRAGEs起着诱导作用，并与循环中的AGEs结合，随后调控与细胞膜相关的RAGEs和AGEs之间的互作。血清中的sRAGEs和AGEs之间的相互作用可以降低不良炎性应答的风险，因为与RAGEs不同，这些合成物被认为能被降解。事实上，据报道慢性炎症患者血清中sRAGEs的水平较低。与RAGEs一样，半乳糖凝集素-3能够与AGEs相互作用，有助于随后的细胞信号传递，同样有助于摄取这些经过修饰的蛋白质。

由于这种受体缺乏跨膜结构域，半乳糖凝集素-3会连接其他AGEs-R膜受体复合物，即AGEs-R1/OST-48和AGEs-R/80K-H。半乳糖凝集素-3上的碳水化合物识别域对乳糖有亲和力，这似乎可以解释其与食品或者饲料源AGEs之间存在潜在的相互作用。激活半乳糖凝集素-3能够改变生物学过程，包括免疫应答和炎症反应。此外，Ⅰ型A 类清道夫受体(scavenger receptor class A1，SR-AⅠ)和Ⅲ型B类清道夫受体(scavenger receptor class B3，SR-BⅢ)[分化抗原簇36( cluster of differentiation，CD36)是巨噬细胞清除受体家族的两个成员，能够结合糖基化蛋白。这两个受体主要推动AGEs的内吞作用，并且在巨噬细胞上大量表达。这些受体与AGEs相互作用后的细胞反应涉及多种功能，包括免疫(过敏或/和炎症)应答。

正如前文所述，RAGEs是公认的AGEs的受体，现有的大多数研究都集中探讨这个受体的功能。RAGEs的结构对其发挥生物学活性至关重要，这一组合的任何修改都会导致功能的改变。高温加热使RAGEs二级结构和三级结构中的氢键和极性疏水的相互作用失真，因此，α-螺旋和β-折叠遭到破坏，并且该蛋白分子的自然折叠和三级结构功能丧失。此外，变性的蛋白质会发生交互联结，并凝聚在一起。两个或多个变性的蛋白分子相互间共价结合，形成新的结构，该结构很可能无法匹配任何亲本分子的特征。这些新的蛋白分子通常体积庞大，构象表位发生改变，可能会被细胞受体识别。Liu等研究表明RAGEs的结合与乳清蛋白的聚集有关。总之，与未进行加热处理的样品相比，加热处理后的糖基化蛋白在构象上发生了改变，同时对受体结合变得更有力，RAGEs受体结合能力更强。综上所述，糖基化蛋白对sRAGEs、CD36、SR-AI和半乳糖凝集素-3具有更高的结合亲和力。

7 总结

综上所述，在食品和饲料的热加工过程中，蛋白质会发生变性、糖基化以及凝聚。蛋白质结构上的这些改变提高了它们对抗原递呈细胞上细胞受体，即sRAGEs、CD36、SR-AI和半乳糖凝集素-3的亲和力。虽然加热处理后的蛋白质和糖基化蛋白均具有较强的受体结合亲和力，但是糖基化的效果通常明显高于热处理的效果。尽管已经证实，MR通过破坏氨基酸和矿物质的生物利用率，降低蛋白质消化率，并提高蛋白质免疫反应性来影响蛋白质的质量，但是为了动物的健康、福利、生长和生产性能，迫切需要更多关于动物食用富含MRPs的日粮对其生理和免疫影响的信息。

原 题 名：Immunomodulation by processed animal feed: the role of Maillard reaction products and advanced glycation end-products (AGEs)(英文)

原 作 者：Malgorzata Teodorowicz、Wouter H Hendriks、Harry J Wichers和Huub F J Savelkoul