纳米羟基磷灰石的制备及在不稳定药物递送中的应用

刘丹，王强，范兴君，高俊霞，于凤波,3

(1.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011；3.广东医科大学附属高州市人民医院，广东 茂名 525299)

1 纳米羟基磷灰石

纳米药物载体(粒径10～1 000 nm)，是一种微观范畴的药物载体输送系统，它的基质材料通常是天然或合成的高分子物质，通过吸附或者包被作用从而将靶药物聚集在亚微粒的内部或表面，用于实现调节药物进入体内后的释放速度、增加膜通透性、提高生物利用度等[1-2]。纳米药物载体一般具有多孔、中空等结构特性，而这些特性使其能够对药物在体内缓慢释放。通过优化载体材料的种类和配比，控制药物的释放速度，最大程度减少用药的次数、剂量，以减轻该药物的毒副作用[3-4]。纳米药物载体材料主要分为两大类——无机类和有机类，其中无机类主要包括纳米羟基磷灰石和介孔硅基材料，有机类包括天然及合成高分子材料。

羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)，作为人体内骨骼和牙齿的主要构成成分，不仅无害副作用，而且具有良好的生物相容性。目前，基于HAP的物理、化学及生物学特性，其往往于骨科充当药物植入载体的角色。此外近年来，有研究尝试将HAP运用于三维打印(three dimensional printing，3DP)技术领域，将其与聚乳酸基质一同作为3DP打印缓释制剂的材料，凸显出了较好的市场应用前景[5-6]。结构决定功能，功能决定用途，具有多种结构的HAP自然也具有各领域的不同用途，其中人工所合成的高密度HAP主要被用于医学骨修复以及骨植入领域的支架材料[7]，而具有高效吸附特性的多孔性HAP往往被应用于核酸及蛋白质等生物大分子的分离及纯化实验。然而，随着HAP尺寸下降达到纳米级别时，其会呈现出一系列的新的独特优异性能，不仅具有很大的比表面积，表现出较常规HAP材料更强的药物吸附与承载能力，并且由于粒径极小(10～1 000 nm)，其能无障碍的通过癌细胞的细胞膜通道，从而进入到癌细胞的内部发挥其生物效应，进而抑制癌细胞的无限增殖[8]。纳米HAP制备方法众多，并且合成所需的各种原材料也廉价易得，采用不同方法制备所获得的HAP具有不同的化学结构与功能。

2 纳米羟基磷灰石的制备

随着科学技术的快速发展，羟基磷灰石的制备工艺得到了显著的改进，目前制备HAP的方法主要包括干法和湿法[9-10]两种合成方案。其中，干法合成方法通常能够获取到化学计量和结晶相对良好的产品，但具有需要相对较高的反应温度以及较长的反应时间等缺陷。此外，该方法还必须通过研磨才能进一步获得纳米粒子。然而，相较于干法合成方法而言，湿法合成方法所需求的反应温度相对较低也更为容易产生纳米颗粒，其不足是该法所制备的产品具有相对较低的结晶度和Ca/P比率。不同的制备工艺制备的HAP在形态结构上存在一定差异。

2.1 干法合成 干法合成法(包括固态合成法和机械球磨法)，又称固相反应法，是以既定的比例将3种固体原料[Ca(OH)2、Ca3(PO4)2、NaOH]相混合，并分散均匀，通过控制水蒸气的温度在1 000 ℃以上，促使一系列反应于相界面上得以发生，从而使固体混合物HAP析出并获得其粉体。

2.1.1 固态合成法 固态合成法[11]是一种利用高温煅烧的方式以各种研磨后的磷酸盐为原料来获得HAP，常用于HAP粉末的合成，这种合成方法的制备工艺相对来说比较简单，但这种在固态条件下合成的HAP粉末具有扩散系数较小的特点，以及粒子的组成具有不均匀性。该制备方法于2001年被Tas等[12]首次报道。具体流程为利用粗制的HAP(微米级)为原料，在硫酸钾(K2SO4)的助熔条件下，多次尝试改变反应过程中的各类条件(包括温度、时间、反应物比例等)，最终于1 080～1 200 ℃得到了呈现出纳米晶须结构的HAP。

2.1.2 机械球磨法 机械球磨法[13]主要用于合成各种纳米陶瓷和塑料合金，通过机械磨球与塑料磨球之间，磨球与热塑料罐两者之间的强力碰撞，使纳米粉末材料发生快速变形、破碎。这些被破碎的粉末在随后的球磨的过程中又再次发生冷却熔焊和融合，再次被球磨破碎，致使晶粒不断细化，可以迅速达到一个纳米数量级。其主要特点在于操作简单、成本低、重现好，但产品颗粒纯度低，颗粒结构分布不均匀。有研究报道[14]，将Ca(NO3)2·4H2O、Na3PO4按Ca/P为1.67比例混合后，于玛瑙钵中分别研磨5 min、20 min，微波加热，乙醇和蒸馏水洗涤产物后，烘干得到HAP粉体。结果表明，该方法成功缩短反应时间，降低反应温度，并制备出不同形貌的纳米HAP。

2.2 湿法合成

2.2.1 水热合成法 水热合成法[15]是指在密闭的高温、高压容器中，用少量水或其他水溶液作为热反应催化剂的加热介质，通过温度及压力的控制使本来难溶或不溶的固体发生溶解并出现重结晶的一种方法(压力锅加热方式：反应温度范围约100～400 ℃，反应的压力约1～200 MPa)。由该方法制得的HAP粉体，它的晶粒发育完整，粒度小且分布均匀，容易获得粉体的化学反应计量物和晶型，但对于反应条件、设备质量要求严格，反应现象复杂，肉眼不容易观察。Lai等[16]采用碳酸钙(CaCO3)为模板，水热条件下通过阴离子交换树脂，在Na2HPO4溶液中成功制备了一种中空的HAP纳米球，其粒径范围在800～2 000 nm之间。此外，Qi等[17]也利用水热法得到了一种片状的HAP，具体方法为：以乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)为螯合剂，尿素为pH调节剂，通过调节水热处理温度和时间，可以很好地控制碳酸化HAP产物的形貌和三维结构。

2.2.2 溶胶-凝胶法 溶胶-凝胶法[18]是指将碱性金属与乙醇盐或其他无机盐等化学原料均匀分散在各种有机溶剂中，而后通过一系列化学反应(高温水解/醋酸醇解)后生成比较稳定而透明的纳米溶胶，该溶胶再经过高温陈化后，逐步聚合，进而反应生成一种具有一定空间结构的纳米凝胶，而后经过干燥、煅烧等手段去除有机成分后制备出各种纳米化学粒子或所需材料。该方案的具体流程为：于磷酸盐溶胶中缓慢滴入钙盐，随后再加入不同量的碳酸氢氨，利用氨水本身的特性调节反应溶液的酸碱度，其后制得的凝胶经陈化、洗涤、干燥、焙烧等工艺最终获得目标产物。该法操作简便、反应温和，但合成过程耗时较长。

Bakan等[19]利用四水硝酸钙和磷酸氢二铵为原料，采用溶胶-凝胶法成功制备HAP，为呈六方形的纳米针颗粒。黄龙宵等[20]以四水硝酸钙和五氧化二磷为原料，制备了颗粒状HAP粉体，将其热处理后得到一种六方形结构的纳米晶体。徐晓虹等[21]利用溶胶-凝胶法制备的HAP，它的结构含碳酸根并且粒径很小，在40～50 nm之间，同时还发现在制备过程中用乙醇作为反应溶剂时，制得的HAP纳米颗粒不仅分散性好，而且仿生性能也提高了。

2.2.3 化学沉淀法 化学沉淀法[22]合成HAP是通过把磷酸盐加入钙盐中，控制Ca/P比例为1.67，充分搅拌完成反应后，加入少量碱性溶液(氨水或氢氧化钠等)调节溶液的酸碱度，产生多个羟基磷灰石盐的沉淀，然后再通过陈化、洗涤、过滤、烘干等多个步骤后，采用400 ℃以上的高温煅烧获取干燥HAP，从而制得纯净的HAP晶体。但值得指出的是：该制备方法不仅在制备工艺条件的要求极为严格，同时，由于所制备条件的限制，其所获得的新型纳米HAP颗粒粒径的均匀性较差，也可能伴随出现严重的团聚扩散现象。孙海娜等[23]用化学沉淀法，以PEG-8000为模板，制备了平均粒径100 nm的Eu3+掺杂的片状纳米HAP。尹美林等[24]用化学沉淀法制备了平均粒径为145 nm的HAP纳米晶，具有较好的稳定性。

2.2.4 酸碱反应法 酸碱反应法[13]主要是根据酸、碱中和反应的原理生成HAP。该方法操作简便，所需设备简单，更适合用于工业化生产，但鉴于其液-固多相反应的属性，易分解成溶胶产物，具有分离相对困难，以及反应时间较长等不足。

2.2.5 水解法 水解法[25]是一种综合反应法，先制备固体前驱体CaHPO4，随后设定相应的水解条件(温度70 ℃)以及酸碱度(pH=8.5)以达到在晶格中加入氢氧根离子的目的，从而得到不同形貌的纳米颗粒。此方法的基本原理是利用水解反应(固体气相液体表面与未溶解的离子)，具有可控性好的优点。Wang等[26]以CaHPO4为原料，在75℃水解制备了粒径范围为13.7～23.1 nm的HAP纳米粉体。

2.2.6 微乳液法 微乳液法[27]是指以含钙和磷酸盐为原料的反应体系中添加表面活性剂(增加反应体系的分散性)，利用水和有机助溶剂的相互作用而形成乳液，进而沉淀析出羟基磷灰石。该方法具有工艺简单，粒径可控(一般分布在10～100 nm)等优势，但该方法收率较低，需要使用大量的有机溶剂，一方面具有较大风险会对人体和环境造成危害，另一方面是其制作成本较其他方法更高。Bose等[28]以表面活性剂为模板，环己烷为油相，硝酸钙和磷酸为水相合成了HAP粉末，其粒径为30～50 nm，结构形貌呈针状和球形。

2.2.7 模板法 模板法[29]是基于某种具有特征结构的物质为模板，于特定实验条件下，计算得到包含模板结构的目标物的方法。例如，利用表面活性剂吸附钙离子和磷酸根离子并进而形成胶束。用该方法所制得HAP结晶粉末不仅其形貌可控，而且具有诸多优点，颗粒分散性高而团聚现象比较轻微。张爱娟等[30]以中空的CaCO3为模板获得了中空HAP微球。但受限于Ca2CO3模板的大小，大规模的运用该方法生产HAP微球是极其困难的。

3 纳米羟基磷灰石在不稳定药物递送中的应用

目前，以RNA为代表的基因药物具有新药开发周期短、序列特异性高、体内具有内源性、毒副作用小等诸多优点。在历经二十几年的研发后，美国三大RNA研发公司BioNTech、Moderna Therapeutics和CureVac AG在多家全球医药巨头的支持下，近年来研发的肿瘤、传染病、心血管等多种疾病的RNA疫苗，纷纷进入临床试验及实际应用当中。由于此类药物在体内极易被核酶发现降解且细胞透过率低，很难到达细胞内发挥药效，因此，将其递送至细胞内的载体技术至关重要。近年来，纳米HAP及其复合材料作为抗生素类药物[31-32]、蛋白质与核酸等基因药物[33-38]缓控释载体材料已有诸多报道。

3.1 纳米羟基磷灰石在抗生素中的应用 Lai等[16]以多孔中空羟基磷灰石微球为载体，盐酸阿霉素(DOX)作为模型药物，探索了其在载药量和药物控释方面的潜在应用。结果显示，制备的聚羟基磷灰石微球在负载DOX时表现出高的载药量和对酸碱度敏感的缓、控释行为。Ait Said等[32]采用固-液混合法，以羟基磷灰石(HAP)、壳聚糖(CS)、环丙沙星(CIP)为原料，通过优化固-液比和少量壳聚糖的使用，制备了羟基磷灰石和壳聚糖聚合物负载环丙沙星抗生素的复合材料。其体外释放试验表明，该局部负载抗生素的代骨材料在菲式扩散机制下，能保证载荷剂量(0.2～2.5 mg·d-1)持续10 d。

3.2 纳米羟基磷灰石在蛋白质分离和纯化中的应用 Esfahani等[33]通过化学沉淀法以3种不同的成分制备了带正电的含锌羟基磷灰石(x-ZH)纳米颗粒，在静电纺丝尼龙-6纳米纤维(NFs)上创建了一个带正电的表面，即牛血清白蛋白(BSA)，以改善带负电蛋白质吸附的分离和选择性。研究结果表明，x-ZH纳米粒子在尼龙纤维中分布良好，具有足够的拉伸强度(4.15～5.70 MPa)，在对BSA进行吸附时，掺锌羟基磷灰石的静电纺丝尼龙膜(N-4ZH：4表示钙位点被锌阳离子所占据，即N-xZH膜中锌含量)对蛋白的吸附时间较长。N-4ZH膜能在1 h内分离250 mg·cm-3BSA分子，表明该膜具有捕获蛋白质的潜力。此外，已有研究团队[34]利用合成的纳米HAP作为载体(以牛血清白蛋白(BSA)作为将负载的药物)，测定不同条件下HAP的吸附量及其负载药物的释放度。相应的研究数据表明，HAP纳米颗粒能够胜任该类缓释药物的载体角色。

3.3 纳米羟基磷灰石在核酸中的应用 研究表明[35]磷酸钙(CaP)基因载体(如HAP)可以克服内体逃逸、酶降解和核吸收的障碍，它不需要使用额外的化合物来破坏核内体。HAP是牙齿和骨骼的主要成分，因此具有高度的生物相容性，不会引发免疫原性或炎症反应。有报道称，Ca2+与带负电荷的基因分子(如DNA和RNA)之间的静电相互作用提高了携带基因的稳定性，这可以保护基因不受细胞质和核降解的影响。Ca2+浓度的增加通过渗透失衡和基因载体分离促进内体破裂，这是发生核酸进入之前所必需的。高可雷等[36]早期研究结果也显示携有NT-3基因的纳米HAP颗粒，不仅可转染到体外培养的小鼠耳蜗神经元中，亦能转染到活体豚鼠的耳蜗神经元内。

Liang等[37]利用羟基磷灰石纳米颗粒(HAP)提供的基于质粒的Stat3特异性短发夹RNA(sh-Stat3)，研究了信号转导子和转录激活子3(Stat3)干扰对体外培养的RM1前列腺癌细胞活力的影响。结果表明，通过促进细胞周期阻滞和凋亡，HAP递送的sh-Stat3显著降低RM1细胞的活力。Balagangadharan等[38]制备出载miR-590-5p的壳聚糖/纳米羟基磷灰石/纳米二氧化锆骨再生支架，利用小鼠间充质干细胞(C3H10T1/2)，在细胞和分子水平上检测生物活性分子(miR-590-5p)对支架的成骨细胞分化的影响。结果显示CS/nHAP/nZrO2支架促进成骨细胞分化，在C3H10T1/2细胞中miR-590-5p的存在进一步增强了这种作用。

4 展望

作为可在人体内应用的药物递送载体，需要具备良好的生物相容性和可降解性，良好的理化和生物稳定性，极低的毒性，以及更高的药物负载能力。HAP的组成与人类骨骼和牙齿大致相同，与其他微生物具有良好的相容性，并且能够于机体内代谢降解后通过消化道随着粪便一同排出体外，因此，其对于机体来说也具备较高的安全性；不同形状的纳米HAP具有极高的比表面积以及载药空隙，因此在纳米级制剂载体中，药物负载能力较强，这也是纳米HAP被选作药物递送系统的必要条件。由目前的文献报道来看，纳米HAP及其复合物是一种具备高载药能力，高保护能力和高转染性能的无机纳米材料。因此，其在未来基因药物及抗肿瘤药物的体内递送方面极具发展潜能。