口服水溶性钙补充剂促进大鼠生长发育研究

陈大力，郭雨萌，李敬民，李雯，王卫平，孙春萌

(1.中国药科大学药学院，国家药品监督管理局药物制剂及辅料研究与评价重点实验室，中国药科大学药用辅料及仿创药物研发评价中心，江苏 南京 210009；2.云南莱德福科技有限公司，云南 昆明 650113)

钙作为人体必需的常量元素之一，在机体组成和正常生命活动中发挥着不可或缺的作用，如骨骼牙齿的形成、神经冲动的产生和传递、心脏节律的维持、激素的分泌、细胞信号传导等[1-3]。为了维持正常生理活动，人体每天需要摄入足够量的钙元素，但是目前钙缺乏已成为一个全球性的营养问题，针对钙摄取不足或需要额外补钙的人群，尤其针对儿童、中老年人、孕期及哺乳期女性群体，选择合适的钙补充剂是最直接有效的补钙方式[4-6]。

随着人口老龄化趋势日趋明显及鼓励生育政策的不断出台，我国人民对钙补充剂的需求日益增加，《“健康中国2030”规划纲要》中也明确提出开展“健康骨骼”专项行动。目前常用的钙补充剂主要包括无机钙、有机钙和天然钙等，其中以碳酸钙为代表的无机钙因含钙量高、价格便宜等优点被广泛使用，如碳酸钙咀嚼片、碳酸钙D3片等[7-9]。但是固体钙的摄取和吸收过程需要消耗胃酸，会对消化功能产生不良影响，甚至可能会引起碱中毒[10-12]。鉴于儿童、中老年人、孕期及哺乳期女性生理情况的特殊性，固体钙补充剂引起的副作用更应受到关注和重视。为解决固体钙补充剂引起的副作用，我们利用酸化反应将矿物钙制成分子结构不稳定的柠檬酸钙和磷酸钙的混合水溶性钙补充剂，与固体钙相比，该产品中钙元素的吸收对胃酸的依赖度较低，可有效避免传统固体钙补钙方式对消化功能产生的副作用。

本实验以碳酸钙为对照，研究了水溶性钙补充剂对大鼠体重、身长、股骨长、骨密度、骨钙含量等关键性生长发育指标的影响，探讨了水溶性钙和固体钙对大鼠生长发育的影响，为新型钙补充剂的开发提供了策略和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 水溶性钙(云南莱德福科技有限公司，钙含量为24.6%，批号:210312)；碳酸钙(浙江省建德市正发药业有限公司，钙含量为39.4%，批号:D2010002)；硝酸(阿达玛斯试剂，批号:P1718914)；盐酸(阿达玛斯试剂，批号:P1725043)；钙单元素标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心，标准值1 000 μg·mL-1，唯一标识218015-1)；钪单元素标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心，标准值1 000 μg·mL-1，唯一标识205009)。

1.2 仪器与设备 DHG-924385-Ⅲ电热鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；BAS124S电子天平(德国 Sartorius 公司)；MDS-6G微波萃取仪(上海新仪微波化学科技有限公司)；iCAP RQ电感耦合等离子质谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；iNSiGHT VET DXA小动物双能X射线骨密度分析仪(奥斯托医疗器械有限公司)。

1.3 实验动物 SPF级健康4周龄SD断乳大鼠，雌性，50只，体重55～75 g，由南京君科生物提供，动物生产许可证：SCXK(沪)2018-0006。大鼠饲养于中国药科大学药学动物实验中心，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2021-0011，室温22～25 ℃，相对湿度 50%～60%，正常昼夜交替，动物自由摄取实验动物饲料，饮用去离子水以避免从饮用水中获得钙。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

1.4 动物饲料 基础动物饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，饲料配方为：10.0%酪蛋白、15.0%黄豆粉、54.0%小麦面粉、4.0%玉米油、2.0%纤维素、2.6%混合矿物盐、1%混合维生素、0.2%氯化胆碱、0.2% DL-蛋氨酸、11.0%淀粉，调整钙含量为0。

1.5 实验方法

1.5.1 动物分组、剂量及周期设置 SD大鼠经适应性喂养1周后，称量体重，按体重随机分为5组，每组10只。设置低、中、高剂量水溶性钙组(钙含量100、200、400 mg·kg-1)，同时设置高剂量碳酸钙对照组(钙含量400 mg·kg-1)和基础饲料对照组(仅给予基础饲料)。按照大鼠体重经口灌胃给予受试物，隔日一次。所有组别实验动物均自由饮食，饮用去离子水，以避免从饮用水中获得钙，实验周期为7周。

1.5.2 观察指标

1.5.2.1 体重、身长 给药前禁食12 h，测定各组大鼠体重、身长。实验期间，每周测量体重、身长一次。

1.5.2.2 股骨干重、股骨长 给药结束，处死大鼠，剥离出双侧股骨，剔除肌肉和筋膜后，随机选取5根左侧股骨于105 ℃烘箱中烘至恒重，称量股骨干重，并用游标卡尺测量长度。

1.5.2.3 骨钙含量 将恒重的左侧股骨置于消解罐中，加入适量王水，采用微波消解法对其进行消化。消解程序：900 W功率，150 ℃消解10 min，180 ℃消解5 min，210 ℃消解10 min。

然后以钪元素作为内标，利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定股骨的骨钙含量(mg·g-1)。以标准品钙元素的浓度(X)为横坐标，相关信号强度(Y)为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线，再根据响应值计算所测样品的钙浓度。仪器检测条件：冷却气流速为14 L·min-1；辅助气流速为0.8 L·min-1；载气流速为1.0 L·min-1；一级真空为2 mbar；二级真空为5×10-7mbar；涡轮转速为999.9 Hz；泵速为40 r·min-1。

1.5.2.4 股骨密度 随机选取5跟右侧股骨，利用双能X射线骨密度分析仪扫描测定整根股骨的骨密度值(g·cm-2)。

1.6 统计学分析 结果用Mean±standard deviation(SD)表示，数据采用Student′s t-test进行组间差异分析，以P<0.05表示统计学具有显著性差异。

2 实验结果

2.1 水溶性钙对大鼠体重、身长的影响 如表1所示，各组大鼠给药前体重和身长均无显著性差异。喂养7周后，对各组大鼠体重及身长数据进行分析，结果表明中剂量和高剂量水溶性钙组的体重和身长均显著高于基础饲料组(P<0.05)，并且高剂量水溶性钙组的体重和身长显著高于高剂量碳酸钙对照组(P<0.05)。

表1 水溶性钙对大鼠体重及身长的影响(n=10)

2.2 水溶性钙对大鼠骨骼发育的影响 大鼠股骨骨长及干重结果如表2所示，高剂量水溶性钙组大鼠股骨长显著高于基础饲料组和高剂量碳酸钙对照组(P<0.05)，低剂量和中剂量水溶性钙组股骨长与基础饲料组无显著性区别(P>0.05)；低、中、高剂量水溶性钙组的股骨干重均显著高于基础饲料组(P<0.05)，并且高剂量水溶性钙组显著高于高剂量碳酸钙对照组(P<0.05)。

表2 水溶性钙对大鼠股骨骨长及干重的影响(n=5)

钙元素浓度(X)与相关信号强度(Y)的线性回归方程为Y=1 884.507 7X+1 653 585.557 3，R2=0.999 3，大于0.999，表明钙元素在0～2 000 ppb 范围内线性良好，符合定量分析要求。通过线性方程计算各组大鼠股骨的骨钙含量，结果如表3所示，低、中、高剂量水溶性钙组大鼠股骨的骨钙含量均显著高于基础饲料组(P<0.05)，高剂量水溶性钙与高剂量碳酸钙对照组相比，骨钙含量无显著性区别(P>0.05)。

大鼠股骨的骨密度结果如表3所示，低、中、高剂量水溶性钙组大鼠股骨的骨密度均显著高于基础饲料组(P<0.05)，高剂量水溶性钙与高剂量碳酸钙对照组相比，骨密度无显著性区别(P>0.05)。

表3 水溶性钙对大鼠股骨骨钙含量及骨密度的影响(n=5)

3 讨论与总结

选择合适的钙补充剂是维持人体正常钙水平的有效措施之一， 但是不同钙剂发挥作用的过程和机理有所不同[13-14]。碳酸钙因具有含钙量高、来源广泛等优势，已成为目前最常用的钙源之一，但是碳酸钙水溶性差，溶解度低，在吸收过程中需要消耗胃酸，会干扰胃部酸性环境，对消化系统产生一定副作用，如消化不良、腹胀、肠胃胀气、便秘等[10，15]。而水溶性钙补充剂中钙元素直接以水溶性钙离子形式存在，对胃肠道安全性较高，是解决固体钙缺陷的有效方式[16-17]。该研究设计了低、中、高3个剂量的水溶性钙实验组，并设置基础饲料组和高剂量碳酸钙组作为对照，通过对SD大鼠关键性生长发育指标进行分析来探究水溶性钙补充剂对大鼠生长发育情况的影响。

机体中的钙大部分存在与骨骼和牙齿中，因此骨骼的生长发育情况是评价大鼠钙吸收水平的重要指标[18]。通过对大鼠股骨生长发育指标进行分析，可以看出水溶性钙补充剂具有增加骨密度的功能，表现为低、中、高剂量水溶性钙组股骨的股骨的骨干重、骨钙含量和骨密度指标均显著大于基础饲料组(P<0.05)，且高剂量水溶性钙组的股骨骨长显著高于基础饲料组(P<0.05)。此外，高剂量水溶性钙组和高剂量碳酸钙对照组大鼠股骨骨钙含量及骨密度均无显著性差异(P>0.05)，股骨长和股骨干重甚至显著大于高剂量碳酸钙对照组(P<0.05)，说明水溶性钙补钙效果可达到甚至优于相同剂量的碳酸钙水平。

实验过程中观察到高剂量碳酸钙对照组大鼠状态持续不佳，喂养7周后体重和身长均显著低于同等剂量的水溶性钙实验组(P<0.05)，可能是由于碳酸钙组大鼠胃酸消耗过多，对胃肠道产生了较大刺激性，使其消化系统受到了一定损伤，对大鼠健康状态、正常摄食及相关营养成分的吸收产生不利影响。而水溶性钙因不需要消耗胃酸，对大鼠健康状况基本不会产生不利影响，摄食及营养成分摄取正常。体重及身长数据可初步说明固体钙补充剂对大鼠健康状态影响较大，长期高频率服用对机体可能具有较大副作用，而水溶性钙则具有较高的安全性。

综合以上各项代谢指标，说明水溶性钙具有良好的补钙效果，对骨密度的增加具有良好作用，安全性和相容性较高，是作为钙补充剂的较佳选择。