UPLC波长切换法同时测定小陷胸汤中4种指标性成分的含量

张雯慧，夏林波，邓仕任，吴佳妮，孙璐，边星

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

小陷胸汤出自东汉名医张仲景所著的《伤寒论》，全方由半夏、黄连、瓜蒌三味药组成。该方具有很高的临床价值，古时多用于治疗邪热内陷、痰热互结于心下所导致的小结胸病，现代小陷胸汤的治疗范围不断扩大，被广泛应用在呼吸系统、消化系统、代谢及泌尿系统等系统性疾病的治疗[1-2]。但目前国内外对于小陷胸汤的研究及其指标性成分含量测定的报道并不多见。腺苷是半夏中含量较高的核苷类成分，具有抗病毒、抗肿瘤、改善细胞代谢等多种生物活性，是判断半夏药材质量优劣的重要依据[3-4]；黄连的主要成分为生物碱类成分，小檗碱和巴马汀为黄连中生物碱类的代表性成分，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗病毒、免疫调节等作用[5]；葫芦素B属于四环三萜类化合物，是瓜蒌中的指标性成分，具有保肝、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性[6-7]。可见，上述4种成分具有抗炎、抗肿瘤、改善糖脂代谢、免疫调节等多种药理活性，是小陷胸汤的特征药效成分。本文采用UPLC波长切换法构建了小陷胸汤中4种指标性成分的含量测定方法，为小陷胸汤的质量控制提供数据支撑和试验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；Centrifuge5804 R冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；AL204型电子天平(梅特勒托利多公司)；KQ2200型超声清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)；Milli-Q Academic超纯水仪(密里博公司)。

1.2 试药 腺苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、葫芦素B等4种对照品，均购自四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均大于98%(批号分别为：wkq19022111、wkq19042309、wkq17112710、wkq18030205)。乙腈为色谱纯(Tedia，美国)；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。黄连、瓜蒌、清半夏等3种中药饮片，均购自大连阳光大药房，经辽宁中医药大学张建奎教授分别鉴定为毛茛科植物黄连(CoptischinensisFranch.)的干燥根茎，天南星科植半夏[Pinelliaternate(Thunb.) Breit.]的干燥块茎经过白矾溶液浸泡后所得的炮制品，葫芦科植物栝楼(TrichmantheskiriloxviiMaxim.)的干燥成熟果实。

小陷胸汤药液，依照《伤寒论》记载，先取瓜蒌饮片20 g，加水1 200 mL，小火煎煮，煎至药液体积为600 mL时，滤去药渣，再加入黄连饮片6 g和清半夏饮片12 g，继续煎煮，煎至剩400 mL药液时，滤除药渣，即得。平行制备3份，得1号、2号、3号小陷胸汤药液。药材信息及自制的小陷胸汤药液信息分别见表1、表2。

表1 药材信息

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件 固定相：Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×150 mm，2.7 μm，安捷伦科技有限公司)。流动相：A相为0.1%甲酸-水，B相为0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脱条件：0～6 min，B：5%→8%；6～9 min，B：8%→35%；9～12 min，B：35%→50%。检测波长：0～10 min，262 nm；10～12 min，234 nm。柱温：46 ℃，流速：0.6 mL·min-1。进样量：3 μL。各色谱峰分离度均大于1.5，以小檗碱峰计算理论塔板数不小于14 500。

表2 小陷胸汤药液信息

2.2 供试品溶液的制备 取小陷胸汤药液1 mL，4 ℃时14 000 r·min-1离心15 min，取上清，即得。

2.3 对照品储备液的制备 取4种标准品腺苷2.00 mg、盐酸巴马汀8.80 mg、盐酸小檗碱18.0 mg、葫芦素B 1.20 mg，精密称定，分别置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解后稀释至刻度，制成浓度分别为0.40、1.76、3.60、0.24 mg·mL-1的对照品储备液。将上述4种对照品储备液等量混合，制成每1 mL分别含腺苷0.10 mg、巴马汀0.44 mg、小檗碱0.90 mg和葫芦素B 0.06 mg的对照品储备液。4 ℃保存备用，用前微孔滤膜过滤。

2.4 线性关系考察 将“2.3”项下对照品储备液逐级稀释，制备7个不同浓度的系列混合对照品溶液，其中腺苷、巴马汀、小檗碱、葫芦素B的浓度分别为0.017～0.17、0.073～0.73、0.15～1.50、0.01～0.10 mg·mL-1，各吸取3 μL，分别注入UPLC，按“2.1”项下要求进行色谱分析。以峰面积Y对各成分的绝进样量X(μg)绘制标准曲线，回归方程见表3。

表3 线性关系考察结果

2.5 重复性试验 取1号小陷胸汤药液，分别按照“2.2”项下供试品溶液制备方法制成6份样品溶液。将各样品溶液依次检测，记录各次峰面积，计算含量。结果各份供试品溶液中腺苷、巴马汀、小檗碱和葫芦素B含量分别为0.052、0.26、0.54、0.036 mg·g-1，RSD(n=6)分别为2.29%、2.31%、1.35%、2.53%，结果表明重复性良好。

2.6 精密度试验 精密吸取“2.3”项下混合对照品溶液3 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果腺苷、巴马汀、小檗碱和葫芦素B峰面积平均值分别为620.0、3 442.3、7 467.3、342.8，RSD(n=6)分别为1.37%、0.91%、0.94%、1.68%，表明仪器具有良好的精密度。

2.7 稳定性试验 取1号小陷胸汤药液，按照“2.2”项下供试品溶液制备方法制成样品溶液，室温条件下密封放置，在0、4、16、24、32、36 h分别进样3 μL进行分析，记录峰面积。腺苷、巴马汀、小檗碱和葫芦素B峰面积RSD(n=6)分别为1.12%、0.85%、0.94%、1.88%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的小陷胸汤(1号小陷胸汤药液，腺苷、巴马汀、小檗碱和葫芦素B含量分别为0.052、0.26、0.54、0.036 mg·mL-1)6份，每份精密量取1.00 mL，置2 mL容量瓶中，分别精密加入0.60 mL的对照品储备液，稀释至刻度，摇匀，制备供试品溶液，进行色谱分析，结果见表4。

表4 加样回收率试验(n=6)

2.9 实际样品测定 分别取3批次制备的小陷胸汤药液，分别制备供试品溶液，进样3 μL进行色谱分析，采用外标法用峰面积计算每个样品中腺苷、巴马汀、小檗碱和葫芦素B等4种成分的含量，结果见图1、表5所示。

1.腺苷;2.巴马汀;3.小檗碱;4.葫芦素B图1 小陷胸汤供试品(A)与混合对照品(B)UPLC色谱图

表5 含量测定结果(mg·g-1, n=3)

3 讨论

3.1 本试验采用UPLC波长切换法测定小陷胸汤中4种指标性成分的含量，与普通HPLC相比，使用UPLC系统可以显著缩短分析时间，减少溶剂消耗，提高分离度和灵敏度。目前对于小陷胸汤质量控制的研究，同时测定小陷胸汤中多种指标性成分含量的报道较少，多以单一组分小檗碱或总皂苷、总生物碱的含量为检测标准。小陷胸汤成分复杂，不同指标性成分的最大吸收波长并不相同，采用单一波长无法保证每个成分都有最大吸收，为提高检测的灵敏度，本试验采用波长切换法进行检测。

3.2 待测的4种指标性成分有不同的吸收波长[8-11]，对4种成分进行全波长扫描，结果显示，腺苷和葫芦素B分别在262 nm和234 nm处有最大吸收，巴马汀和小檗碱均在波长265、340 nm附近有较强的吸收峰，综合考虑后，选用262 nm作为测定波长可以同时测定腺苷、小檗碱、巴马汀3种成分，葫芦素B的测定波长则选用234 nm。

3.3 为了评价经典方剂小陷胸汤的质量，本试验采用传统煎煮法进行提取。最终检测结果显示，3批小陷胸汤中4种指标成分的含量基本稳定，说明传统煎煮法具有一定的科学性和稳定性。同时我们也看到，不同批次间葫芦素B含量的稳定性，较其他3种成分要差，其原因可能是由于传统煎煮法采用水提取，而葫芦素B为脂溶性成分，因此不易提取完全，由此产生了一定的批次间差异。在下一步的研究中，计划进一步优化提取方法，以提高葫芦素B含量的稳定性[12]。

3.4 本文基于UPLC波长切换法建立的含量测定方法可同时测定小陷胸汤中腺苷、巴马汀、小檗碱、葫芦素B等4种指标性成分的含量，该方法简便高效、稳定准确，有望为小陷胸汤的质量控制提供相关科学依据。