实验动物牛棒杆菌感染危害与防控措施*

2022-03-23尹良宏郑天威宫世玲罗立平

实验动物科学 2022年1期

陈曦尹良宏郑天威殷悦张萌宫世玲周倩罗立平刘腾周毅田军韩雪

(北京维通利华实验动物技术有限公司，北京 100012)

棒状杆菌(Corynebacteriumspp.)相关的过度角化症(Corynebacterium-associated hyperkeratosis)是由牛棒状杆菌(Corynebacteriumbovis)引起的裸鼠急性、高度接触性传染病，以过度角化性皮炎、棘皮症为特征，典型的临床症状为全身出现鳞皮样白色皮屑，黏附皮肤表面，俗称“鳞皮病(scaly skin disease)”[1]。裸鼠感染牛棒状杆菌后，除了引起一过性过度角化性皮炎和棘皮症之外，对化学治疗药物毒性敏感性提高、体质量减轻及降低移植肿瘤的生长速度，因此不适于再进行肿瘤学、免疫学及毒理学研究。欧洲实验动物科学联合会(FELESA)将牛棒状杆菌列为其他必要性病原，但2010年我国首次报道该病，目前还没有将此病原列为啮齿类实验动物必检项目。近年来，随着实验动物资源及生物样本资源共享增加，该病原在国内实验动物设施多次检出。由于牛棒状杆菌的高度传染性、可经气溶胶传播、在环境中很难清除等特性，一旦发生牛棒状杆菌感染，对动物设施管理及后续的裸鼠饲养和科学研究带来较大的风险[2]。

1 病原学

牛棒状杆菌属于棒状杆菌属(Corynebacterium)，革兰氏染色阳性小杆菌，呈棒锤状或微弯曲、排列不规则、可散在或成对或呈V形或栅栏状排列、无荚膜、无鞭毛、不产生芽胞且为条件性致病菌。

2 流行病学

牛棒状杆菌的主要传染源为感染该菌的小鼠和其他动物体外接种用的细胞。Clifford等[3]和Field等[4]均报道，该菌在动物间通过直接接触传播，如：空气传播、人员接触或通过污染物如饲养员手套、实验器具、垫料、饲料等。牛棒状杆菌也可通过异种移植物传播，如移植肿瘤系。免疫正常的大鼠和小鼠感染后发病率和死亡率均低，致死率一般不足1%，但裸鼠发病率超过50%，病死率与设施类型、日常操作流程及感染途径密切相关。

感染牛棒状杆菌的小鼠，无明显的品种、品系、性别和年龄差异(表1)，但是不同品系感染该菌后的发病情况和病原携带时间有较大差异。免疫正常大鼠和小鼠通常为无症状携带者，短暂携带病原，但裸鼠非常易感，感染后潜伏期通常为7～10 d。Holly等[8]证实，从未接触过病原体的裸鼠感染后可迅速产生“鳞屑”典型症状，黏附皮肤表面，并长期携带病原；免疫缺陷有毛小鼠偶尔出现脱毛现象，短暂携带病原。

表1 牛棒状杆菌易感品系

3 临床症状

感染牛棒状杆菌的裸鼠伴随体质量减轻、摄水量增加、异种移植物生长缓慢、对化学疗法的敏感性增加、成年裸鼠死亡率升高等现象。如果动物感染后存活，角化增生会消失，但棘皮病持续，真皮层炎症细胞会稍微减少。牛棒状杆菌可迅速引起从未接触过病原体的动物产生“鳞屑”症状，即感染动物全身出现鳞片样白色皮屑，黏附皮肤表面，俗称“鳞皮病”。病变通常出现在暴露感染(如暴露于已感染动物或设施)7～10 d后，是新生动物牛棒状杆菌感染典型特征。“鳞屑”临床症状在14～20 d消除后，动物仍处于感染状态并散播病原体。Holly等[9]报道，曾被感染过的动物群体可呈持续感染状况，但症状与从未接触病原体的动物比较轻很多，例如：SCID等有毛的免疫缺陷鼠出现脱毛、形成秃块等症状。

4 病理变化

组织病理学观察可见被牛棒状杆菌感染的动物皮肤表皮增生、过度角质化、棘皮层增厚及轻度皮炎。白玉等[10]介绍，在受感染动物的皮肤表面角质和毛囊内可见革兰氏阳性菌、巨噬细胞及嗜中性粒细胞浸润，革兰氏染色可在超角化层中观察到牛棒状杆菌。

5 实验室检测和诊断

5.1 细菌分离和鉴定

按照邢进等[11]方法，无菌操作采取疑似感染牛棒状杆菌动物的皮肤拭子、皮屑及呼吸道分泌物，接种于含有5%羊血的哥伦比亚CNA培养基，(36±1)℃、5% CO2条件下培养48 h，观察是否有可疑菌落，如菌落形态为1～2 mm，光滑、点状、白色且不溶于血，经革兰氏染色为阳性短杆菌，V型排列，则可继续进行菌落纯化和生化鉴定。

5.2 PCR检测

目前，实验室多采用qPCR方法检测受感染动物的皮肤拭子、粪便、口咽样品或污染环境物拭子，也可检测肿瘤系及环境棉拭子。qPCR是通过两条标记的荧光发射基团和荧光淬灭基团的引物对牛棒状杆菌16s rDNA进行扩增[12]。

5.3 鉴别诊断

牛棒状杆菌感染需要和弥散性皮炎进行鉴别诊断。从发病率来说，弥散性皮炎通常为散发，而牛棒状杆菌感染发病率可达到50%以上。从病理学上来看，皮肤棘层增厚为牛棒状杆菌感染小鼠的特有表现之一，也可结合实验室诊断，如细菌的分离培养鉴定和分子生物学方法进行确诊。

6 被感染设施的消毒和净化

6.1 首次发生牛棒状杆菌感染

动物设施首次发生牛棒状杆菌感染时，首要目标是筛查感染范围、加强消毒、控制感染范围，并尽快清除病原。当发现某个笼盒内有动物出现皮屑症状时，及时取样送检，同时立即停止该笼盒的任何操作，将该笼盒密封，饲料垫料高压灭菌后进行无害化处理，动物做淘汰处理。整个房间作为疑似感染房间，进行房间多点筛查(超净台、房间环境、排风口)，控制人员和物料进出，加强消毒措施。一旦检测确诊为牛棒状杆菌感染，建议无害化处理该饲养房间内所有动物，并过氧化氢(H2O2)熏蒸净化。

6.2 持续发生牛棒状杆菌感染

若使用已发生过牛棒状杆菌感染的IVC饲养系统，且短时间内动物房无法做到彻底净化，则首要任务是降低环境中的牛棒状杆菌菌群量，以保护易感动物及降低动物感染率。当某个笼盒中，有裸鼠出现皮屑症状，应尽快将该笼盒内动物实施安乐死，并对动物尸体和笼内饲料、垫料和饮水进行无害化处理，在安乐死和转移污染物时要注意避免二次污染。如果感染牛棒状杆菌的动物模型十分珍贵无法替代或已接近实验末期，研究结果十分重要，考虑到IVC系统的相对隔离作用，可以将受感染动物继续饲养一段时间以尽可能减小研究损失。此时，所有换笼操作必须在生物安全柜中进行，且注意最后操作有症状动物的笼盒，并对该笼盒(包含盒内物料)进行高压灭菌处理。为尽可能地降低传播风险，减少笼盒饲养的动物数，更换笼盒的频率可降低为两周一次。操作后要对所用仪器、设备、物料、房间、工作服等进行严格消毒处理。实验结束后，立即对整个饲养房间和操作间进行彻底净化。

6.3 消除牛棒状杆菌的成功经验

Emily等[13]和Ragland等[14]报道显示，使用H2O2消毒剂配合H2O2发生器和加速器进行设施消毒净化，可成功净化牛棒状杆菌感染的设施。将饲养间内的IVC断开连接，其上所有笼盒转移到已消毒干净的IVC笼架并放置在中转间过夜等待消毒完毕。卸下笼盒被污染的IVC笼架转至清洗间清洗[13]。对饲养间内的超净台表面进行消毒，并更换过滤装置；饲养间内架子、抽屉等打开，对其他仪器表面进行消毒，封闭饲养间的进、出风口，将H2O2发生器和加速器转入饲养间，当天进行H2O2熏蒸。消毒结束后，检测H2O2浓度，低于1 mg/L才能允许人员再次进入，同时将中转间的IVC笼盒和笼架转移至饲养间[13]。

房间净化后，需要检测牛棒状杆菌，建议采用PCR方法鉴定牛棒状杆菌[13]。采样对象包括房间和走廊表面、IVC笼架排风总管、IVC通风单元出风口过滤网、连接软管、固定和可移动设备表面及小鼠粪便。Emily等[13]报道，采样频率以月为单位，房间H2O2熏蒸以半年为单位整个设施循环进行。

7 人源肿瘤组织移植过程中消除牛棒状杆菌感染

如果荷瘤鼠感染牛棒状杆菌，出于实验需要继续使用这些肿瘤组织，因此无菌操作，防止牛棒状杆菌污染的肿瘤组织将病原传播给阴性的裸鼠至关重要，建议可采用Christopher等[15]报道的流程进行操作。

7.1 肿瘤摘取

根据Christopher等[15]方法，供体小鼠(经检测为牛棒状杆菌阳性)经CO2安乐死，立即转移至指定生物安全柜内，完全浸泡在2%葡萄糖酸氯己定(CHG)溶液中至少5 min。从CHG浸泡液中取出供体小鼠，使用无菌纱布去除多余浸泡液。专门一套器械操作小鼠皮肤，垂直于背部中线剪开背部皮肤，用手扩张皮肤切口以充分暴露肿瘤组织，使用另一套器械摘取肿瘤组织，快速放入转移液中。遇到肿瘤组织与皮肤深层黏连或肿瘤已经溃烂，摘取肿瘤时不要留下可能与皮肤接触的部分，只摘取安全部分以确保取材的肿瘤组织无牛棒状杆菌感染。

7.2 肿瘤转移

根据Christopher等[15]方法，肿瘤组织摘取后，快速放入有转移液的离心管内，立刻旋紧盖子，用消毒液喷雾外表面，再用浸泡过消毒液的一次性无菌布擦拭消毒。随后，离心管逐个用浸泡过消毒液的一次性无菌布包裹，作用5 min后带出房间，转到指定的洁净操作区域。肿瘤组织转移至无菌培养皿中，剪成3 mm3的碎块，用于移植。用异氟烷麻醉确认无牛棒状杆菌感染的受体小鼠，并用75%乙醇擦拭消毒接种部位皮肤。使用套管针将肿瘤块注射到受体小鼠背部两侧靠近臀部位置。如果需要切开皮肤进行手术原位移植，可剪开5 mm大小切口，手术钳撑开皮肤，将肿瘤块埋入皮下特定位置，再用缝合夹缝合伤口。