耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的临床分布及耐药性分析

黄晓春，马炜，刘云，万玉香，李亚周，张艳君，邓嫦姿，秦琴

肠杆菌科细菌是院内感染的一类主要致病菌，4 具有极强的环境适应能力，可引起肺炎、脑膜炎、关节炎、尿路感染等一系列严重感染［1］。其中耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）是目前临床最为棘手的耐药菌之一。碳青霉烯类药物的表型抗性通常是由两种主要机制引起的：β-内酰胺酶活性与结构突变相结合，产生碳青霉烯酶，这些酶可水解碳青霉烯类抗生素，如丝氨酸碳青霉烯酶、金属β-内酰胺酶、苯唑西林水解酶-48 等［2-4］。前一种机制是产生质粒编码的广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases, ESBLs）和头孢菌素酶（AmpC）。当与孔蛋白突变结合时，ESBLs 和AmpC 能够赋予碳青霉烯耐药性。孔蛋白是革兰氏阴性菌外膜的蛋白质家族，当其改变或丢失时，可以使抗生素在细菌膜上的扩散速度减慢到足以促进ESBLs 和AmpC 酶发挥其作用［3，5-6］。目前研究发现，与革兰氏阴性菌中碳青霉烯抗性相关的其他机制还包括药物外排泵和青霉素结合蛋白的改变［7］。2019 年美国疾病预防控制中心（centers for disease conmtrol and prevention，CDC）发布抗生素抗药性威胁报告将CRE 列为紧急威胁，是最需要紧急处理的五类细菌之一。根据中国耐药监测网监测显示，CRE 检出率呈逐年上升趋势［8］。为了解海军军医大学第一附属医院CRE流行状况及耐药特征，以及为临床防治多重耐药菌感染提供依据，本研究对该院2015－2019 年CRE分布特点和耐药情况进行了回顾性分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2015 年1 月至2019 年12月海军军医大学第一附属医院临床分离的CRE（对亚胺培南、美罗培南或厄他培南中的任一种药物耐药的肠杆菌科细菌），剔除同一患者同一标本类型分离到的重复菌株。

1.2 病原菌培养鉴定及药物敏感性试验 菌株的分离培养严格按照《全国临床检验操作规程》（第四版）进行［9］。使用VITEK 2 Compact 全自动微生物分析仪（法国梅里埃公司）或Microflex 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（德国布鲁克公司）进行菌株鉴定。使用VITEK 2 Compact 全自动微生物分析仪进行菌株药物敏感性试验，分析仪未包含的药物和有局限的药物采用纸片扩散法（Kirby-Bauer法，K-B 法；纸片购自英国Oxoid 公司）进行药物敏感性试验，试验结果按美国临床实验室标准化协会（clinical and laboratory standards institute，CLSI）M100－S29 标准进行判读［10］。通过改良Hodge 试验确证CRE 的表型，并采用多重PCR 技术对这些CRE 进行了碳青霉烯类耐药基因的检测。

1.3 质量控制 质控菌株为大肠埃希菌（ATCC 25922、ATCC 35218、ATCC 8739）、铜绿假单胞菌（ATCC 27 853），均由上海市临检中心提供。

1.4 统计学处理 采用WHONET 5.6 软件和SPSS 23.0 统计软件进行数据统计学分析，计数资料采用菌株数和率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRE 的检出率 2015 年1 月至2019 年12 月共分离肠杆菌科细菌9 973 株，其中CRE 菌株887株，检出率8.89%（887/9 973）。2015 年至2019年各年的CRE 检出率呈逐年升高的趋势，见表1。在CRE 感染患者中，与50 岁以下患者相比，年龄在50岁以上的患者明显增多，占69.11%（613/887），差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 2015－2019 年各年CRE 检出情况及检出率情况

表2 CRE 患者年龄分布情况及构成比情况

2.2 CRE 科室分布 887 株CRE 的科室分布以烧伤科为主，共203 株，占22.89%；其次分别为急救科160 株（18.04%）、心外科102 株（11.50%）、泌尿外科70 株（7.89%）及消化内科56 株（6.31%）等。2015 年1 月至2019 年12 月器官移植科共检出肠杆菌科细菌42 株，其中CRE25 株，发生率达59.52%；其次分别为烧伤科40.36%（203/503）、心外科26.77%（102/381）、急诊科22.04%（160/726）及消化内科21.05%（56/266）等。见表3。

表3 2015－2019 年CRE 来源科室分布、发生率及构成比情况

2.3 CRE 标本类型分布 887 株CRE 主要来源于痰及支气管肺泡灌洗液，共338 株，占38.11%；其次分别为尿176 株（19.84%）、分泌物97 株（10.94%）、血90 株（10.15%）及引流液74 株（8.34%）等。2015 年1 月至2019 年12 月痰及支气管肺泡灌洗液中共检出肠杆菌科1 853 株，其中CRE 共338 株，发生率占18.24%；其次分别是分泌物11.99%（97/809）、胆汁8.74%（16/183）、脓液8.66%（22/254）、血液8.23%（90/1 094）及引流液8.07%（74/917）等。见表4。

表4 2015－2019 年CRE 标本来源分布、发生率及构成比情况

2.4 CRE 病原菌分布 CRE 菌株中分离的细菌主要为肺炎克雷伯菌，共609 株，占68.66%；分列第二至第五位的分别为大肠埃希菌95 株（10.71%）、阴沟肠杆菌复合群90 株（10.15%）、产气克雷伯菌25 株（2.81%）及奇异变形杆菌23 株（2.59%）。具体分布见表5。

表5 2015－2019 年CRE 分离菌种分布及构成比情况

2.5 CRE 的抗菌药物敏感性试验结果 CRE 菌株对哌拉西林/他唑巴坦和头孢吡肟耐药率稍低，分别为58.1%和59.3%，对其余临床常用抗菌药物耐药率均＞60%；而对同属于碳青霉烯类抗菌药物的亚胺培南及美罗培南的耐药率为79.3%及76.9%，与厄他培南的耐药率97.4% 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。CRE 菌株中不同细菌对抗菌药物的耐药率不同。见表6。

表6 CRE 对常用抗菌药物的耐药率［株（%）］

3 讨论

近年来，全球范围内抗菌药物耐药情况正在迅速变化，多重耐药菌（multidrug-resistant organisms，MDROs）的流行是一个主要的公共卫生威胁，其在全球范围内的持续增加，与严重疾病的发病率和死亡率相关［4］。在过去的时间里，多重耐药菌的院内感染和社区感染之间的区别已经变得模糊，而能够在医院内外细菌之间有效传播的移动基因元件（mobile genetic elements MGEs)上的抗菌药物耐药基因呈爆炸式增长［11］，且这种趋势在肠杆菌科细菌中尤为突出。碳青霉烯类抗菌药物通常被认为是治疗严重细菌感染的最有效的药物，但随着其使用的增多，耐药率激增，CRE 成为全球最主要的抗菌药物有耐药性的菌种之一［12-14］。

根据中国细菌耐药监测网监测结果显示，肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药率连年升高，其中肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率从2005 年到2018 年耐药率上升幅度超过8 倍［9］。本研究通过对海军军医大学第一附属医院2015 年至2019 年临床分离的CRE 进行分析显示，检出率上升趋势与耐药监测网分析数据保持一致，而分离到的细菌种类亦与国内外近年CRE 分离细菌类别一致［15-17］。50 岁以上患者分离CRE 菌株数明显高于50 岁以下患者，多项研究表明老年患者基础疾病多、住院时间长、免疫力低下等均是CRE 医院感染的高危因素［18-20］。

本研究的CRE 菌株主要分布于烧伤科监护室。通过对科室因素进行分析，烧伤科监护室收治患者以危重烧伤患者和多发伤患者为主，病情危重，大多接受气管插管、留置导尿管、使用呼吸机等侵袭性操作，并大量使用碳青霉烯类抗菌药物和替加环素等，这些均是导致CRE 定植并侵袭感染的危险因素［21］。CRE 在不同标本来源中以痰及支气管肺泡灌洗液为主，与刘周等［22］、李勇等［23］相关研究结果相一致。CRE 引起血流感染的风险在所有标本中位列第四，根据本实验室前期报道［24］，本院首次从非血液标本中分离菌株后有5.9%后续发生血流感染，且首次分离的标本不同，后续发生血流感染的情况也有差异，其中冲洗液、引流液、分泌物中分离后血流感染的发生率较高。由于血流感染预后差、病死率较高［25］，故当由引流液、分泌物等分离出CRE 时应提高警惕，注意隔离消毒，降低病死率。

碳青霉烯类抗菌药物耐药率分别为厄他培南97.4%、美罗培南76.9% 及亚胺培南79.3%，其他抗菌药物多呈现广泛耐药。本研究药敏结果显示除哌拉西林/他唑巴坦和头孢吡肟（耐药率分别为58.1% 和59.3%）外，其他抗菌药物耐药率均＞60%；相比 2013-2014 年阿米卡星耐药率29.4%［26］，2015－2019 年阿米卡星耐药率增长了42.1%，高达71.5%。其原因可能是VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析仪测得的CRKP 对阿米卡星的最低抑菌浓度偏低［27］，2015 年起将阿米卡星药敏仪器法更换为K-B 法复核后纠正了这一现象。肺炎克雷伯菌除阿米卡星（65.8%）外，其他抗菌药物药敏结果均呈现高耐药性，耐药率＞70%。大肠埃希菌对头孢类抗菌药物呈现出高耐药状态，药敏实验结果与徐佳丽等人研究结果相近［28］。由于CRE 呈现的高耐药情况，临床选择用药十分有限，甚至出现无药可用的现象。针对这些情况，国内外普遍采用以碳青霉烯类药物联合多黏菌素和替加环素的用药方式对临床患者进行治疗，此为目前临床治疗重要手段［29-31］。

随着CRE 检出率逐年上升，控制院内感染将迎来严峻的挑战。通过提高医护人员无菌意识，如加强隔离措施、CRE 耐药监测指导临床合理使用抗菌药物以及早期CRE 筛查进行预防干预等措施，减少CRE 院内感染的发生。