金银花对肺癌基因表达生物信息学和分子对接研究

廖 黎，鲁 兰，杨 晨，刘 昆，赵玉婷

(成都大学 四川抗菌素工业研究所/药学院 抗生素研究与再评价四川省重点实验室，四川 成都 610106)

0 引 言

肺癌是起源于支气管黏膜、腺体或肺泡上皮的恶性肿瘤性疾病，据2018年全球癌症统计数据显示，肺癌是全球第一大癌症，是癌症发病和死亡主要原因之一[1].肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)与非小细胞肺癌(NSCLC)，其中非小细胞肺癌占比约80%，具有不良预后及恶性转移潜能.目前，肺癌治疗主要依赖于放疗、化疗等，但这些治疗存在毒副作用大、降低患者生活质量等问题；另外，靶向治疗、免疫治疗作为新型疗法，也存在药物耐受性、治疗周期长、费用高等问题[2].中药治疗作为辅助疗法，对肺癌患者机体作用温和，毒副作用小，还可提高化疗疗效、降低不良反应及毒性，提高机体免疫力，延长患者生存期[3].如四味金银花汤联合化疗治疗中心型NSCLC，与单纯化疗方案相比，治疗有效率、生存率显著提高，毒副反应降低[4].因此中药作为潜在的抗肺癌治疗药物，其物质基础和作用机制受到更多关注.

金银花为忍冬科植物忍冬(lonicera japonica thunb)的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、疏散风热[5]，用于治疗痈肿疔疮、热毒血痢、风热感冒等疾病.现代药理研究表明，金银花具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节等作用[6]；抗肿瘤方面，金银花对肺癌、肝癌、前列腺癌等癌症有较好的治疗作用[7-8]，但治疗癌症物质基础、作用机制尚不明确.本研究为进一步了解金银花治疗肺癌作用机制，通过生物信息学技术，筛选与肺癌发生转化等生物信息有关功能基因，并与正常肺组织比较获得表达差异显著基因(DEGs)[9]；另外，通过网络药理学，包括评估金银花吸收、分布、代谢和排泄(ADME)特性，筛选其有效成分及治疗肺癌相关靶点[10]，分析靶点富集功能及通路，再通过对肺癌预后价值分析得到金银花治疗肺癌关键靶点，并与对应成分进行分子对接，从而探究金银花治疗肺癌有效成分、靶点及作用机制.为金银花在治疗肺癌的开发和应用提供理论依据和新的契机.

1 材料与方法

1.1 公共数据收集

美国国立生物技术信息中心(NCBI)基因表达综合数据库GEO(http://www.ncbi.nlm.gov/geo/)，是高通量基因表达、芯片和微阵列数据的功能基因组学数据库[11].从该数据库中下载人源肺癌数据芯片GSE118370微阵列数据(芯片信息：Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，GPL570平台).该芯片以6例侵袭性肺腺癌组织及6例正常肺组织为研究对象.

1.2 差异表达基因的筛选处理

用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)在线工具筛选肺腺癌组织和正常组织中的差异表达基因(DEGs)，筛选标准为P<0.05，|log2FC|>1.GEO2R是一个交互式的网页工具，它可以比较GEO系列中的两个或多个数据集，以确定实验条件下的差异表达基因.利用Bioconductor注释数据软件包将微阵列数据探针名称转换为标准基因名称[12].

1.3 金银花有效成分和靶点的收集整理

中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cdu.cn/tcmsp.php/)中输入“金银花”，以ADME系统评估模型，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18筛选金银花有效成分[13].用有效成分筛选金银花潜在靶点，去除重复和无靶点成分.在通用蛋白数据库(Uniprot，http://www.uniprot.org/)将得到的靶点转化为基因名，设置种属为人.金银花有效成分-靶点导入Cytosacpe3.7.1软件中构建金银花有效成分-靶点网络图，节点表示数据类型，之间连线表示其相互作用.用Network Analysis工具对该网络图进行分析，根据Degree值，筛选出金银花的核心成分和靶点.

1.4 获得肺癌相关靶点

在Gene数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中输入“lung cancer”，设置种属为人，用Relevance score对基因从大到小排序(依据zscore值)，得到人类肺癌基因.

1.5 蛋白交互PPI网络图建立

通过Venn分析工具，将金银花有效成分靶点、肺癌相关靶点与差异表达基因叠加，取交集，将上述交集靶点导入string数据库(http://string-db.org/)，设置种属为人，去除无连接靶点，minimum required interaction score设置为0.4，预测蛋白相互作用.再将分析结果导入Cytosacpe3.7.1软件构建蛋白交互网络图(Protein-Protein Interaction，PPI).使用CytoHubba插件对其网络进行关联度分析[14]，根据节点度大小筛选关键靶点.

1.6 基因本体与通路富集分析

在DAVID数据库(http://david.ncifcrf.gov/)中，将上述筛选靶点进行基因本体(Gene Ontology，GO)生物富集分析，以P<0.05作为筛选标准，用生物学过程(Biological Process，BP)、细胞组分(Cell Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)结果绘制GO注释图.在KOBAS数据库(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)对靶点进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路注释分析，以P<0.05作为标准筛选.此外，通过Cytosacpe3.7.1软件构建通路-靶点-有效成分网络图.

1.7 肺癌相关表达基因的预后价值分析和基因表达谱交互分析

GEPIA(http://GEPIA.cancer-pku.cn)可用于分析肿瘤和健康样本的 RNA 序列数据，提供差异表达分析、轮廓绘制、相关性分析、患者生存分析、相似基因检测和降维分析[15].分析筛选靶点对肺癌患者的总生存期(Overall Survival，OS)，根据肺癌患者这些靶点表达情况及中位值分为高表达和低表达2组，并计算危险比(HR)及其95%置信区间和对应的P值，绘制生存曲线.通过Student’s t检验分析肺癌组织与正常肺组织基因的表达.筛选在肺癌生存率中差异较大的基因进行基因表达谱分析，采用F检验分析,以P<0.05为差异有统计学意义.

1.8 免疫组织化学分析

免疫组织化学是组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织呈色反应，借助标志物对相应抗原或抗体进行定位、定性以及定量检测.利用Human Protein Atlas(HPA)数据库(http://www.proteinatlas.org)分析交集靶点在正常及肺癌组织中蛋白质表达情况.根据蛋白质在组织中染色强度及染色细胞百分比，比较正常组织与肿瘤组织中蛋白质表达差异.

1.9 分子对接

筛选肺癌生存率中差异较大靶点，在PDB数据(https://www.rcsb.org/)中输入，设置种属人，选择X-射线晶体结构，下载相关蛋白3D结构，通过PyMOL软件去除蛋白中的配体和水分子，AutodockTools软件对蛋白进行加氢、加电荷.根据靶点对应的金银花核心成分，在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载化合物3D结构，用AutodockTools对化合物进行移除非极性氢.根据蛋白质自带的配体设置Grid Box坐标，用Autodock Vina进行分子对接，取化合物与蛋白结合能最小构象绘图，分析验证金银花关键活性成分与靶点相互作用[16].

2 结 果

2.1 肺癌组织中基因表达差异分析

将GSE118370芯片中的6例正常肺组织设为normal组，6例侵袭性肺腺癌组织设为tumor组，用GEO2R分析，筛选出 3 687 个差异表达基因，其中 1 464 个为上调基因，2 223 个为下调基因，见图1.红色代表上调基因，绿色代表下调基因，灰色代表无显著差异基因.

图1 GSE118370基因表达及分布火山图 图2 金银花、肺癌及GSE118370交集靶点筛选

2.2 金银花有效成分和靶点筛选结果

在TCMSP数据库中，筛选得到金银花有效成分23个.这23个成分中，有6个成分没有对应靶点，去除重复靶点，将得到靶点在Uniprot数据库中转化为基因名，得到170个靶点基因.

2.3 肺癌靶点基因筛选结果及蛋白交互PPI网络图构建

在Gene数据库中筛选出 23 107 个基因组与人类肺癌相关.用Venn将其与金银花成分靶点及GEO中肺癌差异表达基因进行交集，得到51个金银花-肺癌靶点，见图2.通过String数据库预测这些靶点相互作用，根据degree排名，节点degree值越大，其在网络图中越重要，选出degree排名前20核心靶点，见表1.将51个交集靶点及degree排名前20靶点用Cytosacpe3.7.1软件构建蛋白交互网络图(PPI)，见图3和图4.根据每个靶点degree值大小确定每个靶点大小.由图4得到20个靶点交互关系图，边线数102条，聚类系数为0.794，平均节点degree值为12.1.这些靶点连通性好，是金银花发挥治疗肺癌作用的核心靶点.

表1 20个核心靶点信息

图3 51个交集靶点PPI图 图4 degree排列前20关键靶点PPI图

2.4 GO生物富集和KEGG通路分析结果

在DAVID数据库中，对金银花治疗肺癌20个核心靶点进行GO生物富集分析，并用P<0.05筛选，最后得到96个GO条目，按照P值由小到大排列，筛选生物学过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)前20个条目，见图5.分析结果显示BP类别中，靶点在RNA聚合酶II启动子转录的调控、DNA模板化、一氧化氮生物合成过程的正调控、药物的反应、基因表达的调控、白细胞迁移、NF-kB转录因子活性的正调控、ERK1和ERK2级联的正调节、MAPK级联的正调节、凋亡过程的调控等.在CC类别中，靶点主要富集于细胞外间隙、胞外体、质膜外侧、核染色质、核质等.在MF类中，靶点主要集中在酶结合、染色质结合、类固醇激素受体、ATP酶结合、类固醇结合、RNA聚合酶II核心启动子近端序列特异性DNA结合，配体激活序列特异性DNA结合，细胞因子活性、转录调控区DNA结合等.

图5 金银花治疗肺癌核心靶点GO富集分析

在KOBAS数据库中，对20个核心靶点进行KEGG通路分析，用P<0.05及与癌症相关性分析筛选，得到49条通路，进行可视化处理，结果见图6.其中，排列靠前与肺癌相关通路包括癌症中的转录失调、癌症的途径、IL-17信号通路、癌症中的蛋白多糖、肿瘤坏死因子信号通路，与癌症相关富集通路包括乳腺癌、膀胱癌、癌症中的MicroRNAs、肾细胞癌、癌症的中心碳代谢、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、铂类耐药、前列腺癌、胃癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌，与癌症相关信号通路包括MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、雌激素信号通路、T细胞受体信号通路、C型凝集素受体信号通路、NOD样受体信号通路、p53信号通路、PPAR信号通路、NF-κB信号通路、FoxO信号通路、Jak-STAT信号通路，与其他疾病及免疫等相关的通路，如类风湿性关节炎、疟疾、乙型肝炎、内分泌抵抗、焦点粘着、造血细胞系、细胞衰老、细胞凋亡、Toll样受体信号通路、Th17细胞分化、Th1和Th2细胞分化等.

图6 金银花治疗肺癌核心靶点KEGG通路分析

2.5 构建金银花成分-靶点-通路网络图

在Cytosacpe3.7.1软件中，将金银花有效成分与51个交集靶点构建金银花成分-靶点网络图，见图7.网络总共包括63个节点(1个药材节点、11个化合物节点、51个靶点节点)和110条边.其中degree值排列前8的金银花成分分别是槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、5-羟基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮、豆甾醇、β-胡萝卜素、金圣草素.它们是金银花发挥治疗肺癌的核心成分.另外,根据筛选的20个核心靶点，构建金银花成分-靶点-通路网络图，见图8，展示多成分、多靶点、多通路金银花治疗肺癌关系，构建药物-靶点-疾病的网络关系图.

图7 金银花“有效成分-靶点”网络图 图8 金银花“有效成分-核心靶点-通路”网络图

2.6 肺癌生存率及相关基因表达分析结果

通过GEPIA在线数据库，使用Kaplan-Meier曲线对20个核心靶点基因进行生存率分析.基因CCNB1、ICAM1、IGFBP3、MET、MMP9不同表达使肺癌生存率有显著差异，见图9，这5个基因低表达组肺癌生存率高于高表达组.采用GEPIA在线分析这5个基因mRNA相对表达量，见图10，左边红色组为肺癌组织，右边灰色组为正常肺组织，其中CCNB1、IGFBP3、MMP9在肺癌组织中相对表达量明显升高(P<0.05).

图9 CCNB1、ICAM1、IGFBP3、MET、MMP9在肺癌中生存分析

图10 CCNB1、ICAM1、IGFBP3、MET、MMP9在肺癌组织和正常组织中表达情况

2.7 免疫组化分析结果

通过Proteinatlas数据库对2.6中筛选的5个基因进行搜索，发现这些基因在肺癌组织中呈现不同程度阳性反应，见图11.通过抗体 CAB003804 在正常肺组织未检测到CCNB1，在肺癌组织呈现中等强度染色，染色细胞比例为25%～75%.通过抗体 CAB002142 在正常肺组织未检测到ICAM1，在肺癌组织呈现中等强度染色，染色细胞比例25%～75%.通过抗体 CAB005282 在正常肺组织低强度检测到MET，在肺癌组织呈现中等强度染色，染色细胞比例>75%.通过抗体 CAB068201在正常肺组织及肺癌组织中均未检测到MMP9.数据库中未找到表达IGFBP3的正常肺组织和肺癌组织.

图11 CCNB1、ICAM1、MET、MMP9在肺癌中免疫组织化代表图

2.8 分子对接验证结果

根据2.6筛选的5个基因，结合其degree值排名，选择CCNB1、ICAM1、MMP9与金银花成分槲皮素、木犀草素分别进行分子对接，对接参数设置及计算结果见表2，对接相互作用见图12.一般配体与受体结合能越低，构象越稳定，发生结合可能性越大，当结合能小于-5.0 kcal/mol表示有好的结合活性[17].对接结果显示，槲皮素、木犀草素与CCNB1结合能分别为-6.9、-7.0kcal/mol，与CCNB1均有强结合性；槲皮素、木犀草素、山奈酚与ICAM1结合能分别为-5.9、-5.8、-5.8 kcal/mol，均小于原配体NAG结合能-4.5 kcal/mol，表明这3个化合物与ICAM1均有强结合性，且比原配体NAG结合性更好；槲皮素、木犀草素与MMP9结合能分别为-8.7、-8.8kcal/mol，均小于原配体NFH结合能-6.9 kcal/mol，表明这2个化合物与MMP9均有强结合性，且比原配体NFH结合性更好.图12是槲皮素、木犀草素、山奈酚与CCNB1、ICAM1、MMP9三维分子对接图，其中蓝线、灰色虚线、绿色虚线分别代表各配体与靶点氨基酸残基形成氢键、疏水作用、芳香共轭体系.

表2 金银花核心化合物与核心靶点结合能

图12 金银花核心成分与关键核心靶点三维分子对接模式

3 讨 论

金银花在我国使用历史悠久，《神农本草经》、《本草纲目》等古籍中都有记载，并有大量临床和人体应用经验[6].临床案例也发现金银花在治疗肺癌和其他癌症上有疗效，有研究发现金银花中槲皮素、绿原酸等成分对肺癌作用，可通过调节如CDK1、CCNB1、Bcl-2等蛋白表达及影响MAPK、PI3K-Akt信号通路等，阻滞细胞周期抑制癌细胞增殖、转移，诱导细胞凋亡[18].但这些研究仅基于“一个药物，一个靶点”的传统研究思路设计.中药成分复杂，可通过多靶点、多途径、多层次整合调控产生协同功效[19].因此，本研究通过网络药理学，将药物多成分、多靶点、多通路关系展示出来，构建药物-靶点-疾病的网络关系图，系统多角度揭示金银花治疗肺癌的药效物质基础及作用机制，并利用生物信息学分析方法，对肺癌基因芯片数据进行挖掘，提供临床检测和治疗肺癌的潜在靶点，从而建立基础研究与临床研究间的联系，最后通过分子对接展现药物成分与靶点间的相互作用，验证金银花治疗肺癌的药效物质基础.

本研究通过网络药理学TCMSP数据库，OB、DL预测经口给药具有一定生物活性的金银花有效成分，并得到金银花“有效成分-靶点”，同时筛选Gene数据库中肺癌疾病基因，并分析GEO数据库中人源肺癌数据芯片GSE118370微阵列数据，并鉴定出在肺癌患者和正常人之间有显著差异的基因.将三个数据库进行交集，得到金银花治疗肺癌“核心成分-靶点”，通过拓扑分析，筛选degree排前20核心靶点，用GO和KEGG研究这些靶点基因富集功能及通路.GO分析表明，这些基因通过细胞转录、基因表达调控、免疫调节、细胞凋亡等参与金银花治疗肺癌作用.KEGG分析表明，这些基因富集于与肺癌直接相关通路，如癌症中的转录失调、癌症的途径、癌症中蛋白多糖、肿瘤坏死因子信号通路、癌症中的MicroRNAs、非小细胞肺癌、铂类耐药、细胞衰老、细胞凋亡等；多条信号通路与抗肿瘤、影响肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡、免疫调节等相关.如肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、凋亡及新血管的生成密切相关的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路[20]；与肺癌、乳腺癌等多种癌症发生相关的磷酯酰肌醇-3激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(PI3K-Akt)信号通路[21]；目前发现的与人类肿瘤相关性最高的人体抑癌基因(p53)信号通路[22]；与自身免疫调节、影响肿瘤的发生发展的转录因子蛋白家族(NF-κB)信号通路；抗炎、自身免疫调节及肿瘤相关的IL-17(白介素-17)信号通路[23]；与肿瘤细胞增殖、侵袭、活化等相关并具有免疫调节作用JAK-STAT信号通路[24].另外，T细胞受体、C型凝集素受体、Toll样受体、NOD样受体等信号通路也协同其他通路发挥着免疫调节及肿瘤相关的作用.此外还有富集于内分泌抵抗、焦点粘着、造血细胞系及类风湿关节炎、疟疾多种疾病通路等.

通过GEPIA在线数据库进一步评估这20个基因不同表达在肺癌生存率中的显著差异，筛选到5个基因CCNB1、ICAM1、IGFBP3、MET、MMP9低表达与肺癌生存率升高显著相关，该结果与GEO数据库分析肺癌GSE118370芯片差异基因表达情况上下调一致.另外免疫组化结果也证实与正常组织相比，肺癌组织中CCNB1、ICAM1、MET基因上调.对这些基因进行文献发掘，也证实它们与肺癌发生发展相关性.CCNB1在调节细胞周期G2/M期进展中期关键作用，抑制其表达可抑制肿瘤细胞增殖及诱导其凋亡，相关研究证实其在NSCLC中高表达患者总生存率较短，此外，它可参与P53、FOXM1-CCNB1信号通路等，对不同肿瘤发生发展起不同作用[25].ICAM1具有促进炎症部位黏连性，影响肿瘤侵袭、扩增、转移及调节机体免疫作用，其在肿瘤组织中呈现高表达[26]，通过研究发现，下调ICAM1基因可以抑制NSCLC细胞生长[27].IGFBP3是胰岛素样生长因子家族(IGFs)成员，IGFs具有促有丝分裂、影响细胞增殖分化凋亡等作用，并与肿瘤发生发展、增殖、侵袭、转移和凋亡关系密切.IGFBP3 是人体含量最多并起最主要调节作用蛋白，可通过抑制 PI3K/Akt/PKB 和 MAPK通路诱导NSCLC细胞凋亡，在临床NSCLC患者血清中，IGFBP-3水平显著低于正常人[28]，此外NSCLC患者中发现IGFBP3在细胞质和细胞核中可同时表达，其中质表达阳性者中位生存时间显著短于阴性者，核表达阳性者中位生存时间显著长于阴性者[29].IGFBP3在核质中不同表达可能造成其无法在Proteinatlas数据库中查找免疫组化结果.MET是NSCLC中重要肿瘤驱动基因，它在NSCLC中过表达，可促进癌细胞生长、侵袭和凋亡; 通过临床发现，NSCLC患者中，MET高表达组5年总生存率明显低于其低表达组，且高表达组具有不良预后[30].MMP9是金属蛋白酶家族(MMPs)成员，肿瘤细胞和周围基质诱导的MMPs过度表达使细胞基质降解，利于肿瘤侵袭和转移；此外MMPs介导细胞迁移、分化、增殖、凋亡、血管生成和炎症反应相关的信号通路，参与肿瘤发生发展.其中MMP9在肺癌发展中起重要作用，它可参与肿瘤增殖、侵袭及转移等过程，特别是在新生血管形成中发挥着重要作用，研究发现在NSCLC患者血清中，MMP9水平显著高于正常人[31].免疫组化中肺癌组织未能检测到MMP9，但GEPIA数据库分析其在肺癌组织中mRNA相对表达量显著升高，这可能是Proteinatlas数据库标本数量有限，我们将在以后免疫组化分析中对其进一步关注.

将上述筛选到的5个基因，结合其degree值排名，与对应筛选金银花核心成分进行分子对接，发现CCNB1与槲皮素、木犀草素；ICAM1与槲皮素、木犀草素、山奈酚；MMP9与槲皮素、木犀草素能通过形成氢键、疏水作用及芳香共轭体系相互作用较好结合，结合能均小于-5.0kcal/mol，其中ICAM1、MMP9与对应成分结合性比原配体更好，更易形成稳定化合物，说明金银花对治疗肺癌应有较好疗效，槲皮素、木犀草素、山奈酚等成分可能成为治疗肺癌的潜在物质基础.槲皮素、山奈酚、木犀草素都是黄酮类化合物，它们可通过阻滞细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭、诱导其凋亡及抑制肿瘤血管生成等发挥抗癌作用，还可通过抗氧化、免疫调节间接发挥抗癌作用.文献报道槲皮素能通过稳定p53、抑制MMP9等从而抑制肿瘤细胞生长、侵袭、转移等[32]，作用于PI3K-Akt、MAPK、IL-6/JAK/STAT3等信号通路抗肺癌等多种肿瘤细胞，还能作用于与P53通路相关多药耐药基因 MDR1(MDM2)上，逆转肿瘤细胞的耐药性[33].木犀草素能稳定p53、抑制p-Akt、MMP9等，作用于PI3K-Akt、MAPK/ERKS、NF-κB等信号通路，并能作为增敏剂和顺铂联用，抑制NSCLC细胞株[34].山奈酚能抑制CCNB1、MMP9及肿瘤中MicroRNA等，作用于MAPK、PI3K-AKT、NF-κB、JAK/STAT等信号通路，抑制NSCLC细胞株[35-36].这些与本研究中网络药理学和分子对接结果相符，展现金银花多成分、多靶点、多通路的协同作用治疗肺癌.

4 结 论

综上所述，本研究通过生物信息学挖掘肺癌基因芯片GSE118370数据，用网络药理学和分子对接方法研究金银花治疗肺癌物质基础、靶点、作用机制，得到51个金银花-肺癌靶点，对应金银花有效成分11个；对靶点进行GO生物富集和KEGG 通路分析，得到与癌症直接相关通路、癌症相关信号通路、免疫调节及其他疾病通路等.通过GEPIA数据库，筛选到靶点CCNB1、ICAM1、IGFBP3、MET、MMP9不同表达在肺癌生存率中具有显著差异；免疫组化结果证实，肺癌组织中CCNB1、ICAM1、MET基因上调；分子对接结果证实CCNB1、ICAM1、MMP9和对应成分槲皮素、木犀草素、山奈酚均能很好结合，进一步证实生信学的分析和推测.通过这些信息我们将进一步认识肺癌发生发展过程，并为金银花作为临床治疗肺癌或辅助药物提供参考.这些研究有助于了解金银花治疗肺癌潜在物质基础和作用机制，为后续的实验研究提供指导.