烈香杜鹃和龙胆花雾化吸入剂的急性毒理作用

孙智娜，雷思，彭菲，何秀琴，卓玛拉毛，吴尚洁*

(1.青海红十字会医院,青海 西宁 810000；2.中南大学湘雅二医院,湖南 长沙 410011)

十味龙胆花始载于《医方甘露精华》，由烈香杜鹃、龙胆花、甘草、矮紫堇、小檗皮、鸡蛋参等10味纯天然药材组成的经典藏药，于1996年生产销售后得以广泛应用[1]，大量的临床和实验研究均表明十味龙胆花在抗炎、解热、抗菌、止咳等方面有很好的效果[1-6],常用于痰热壅肺所致的咳嗽、喘鸣、痰黄，已被证实在慢性阻塞性肺疾病、社区获得性肺炎、支气管哮喘等疾病中有确切的临床疗效[7]。其中，烈香杜鹃和龙胆花作为方剂的君药，具有清热燥湿的重要作用[8]。雾化治疗在气道疾病治疗中具有独特的优势，目前应用广泛,但在十味龙胆花中的研究甚少。本研究将十味龙胆花的君药龙胆花和烈香杜鹃两味药材进行提取，将其提取液制作成雾化液，并探索小鼠雾化吸入该两种药材提取液的药物浓度及急性毒理作用，为后续十味龙胆花的临床雾化研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

自制14 cm×24 cm×45 cm透明塑料雾化室，超声雾化器(江苏康尚雾化器408D)；药物：烈香杜鹃及龙胆花均由湖南中医附一中药研究所鉴定合格，去除不利于机体吸收的纤维素等，再对该药材进行水提取，最后浓缩成棕黄色果酱样液体，具体浓度为：烈香杜鹃提取液原始浓度为2 g/mL；龙胆花提取液原始浓度为0.77 g/mL。血生化相关指标测定仪器：TEK8530全自动五分类血液分析仪(江西特康科技有限公司);博科BK-200全自动生化分析仪(BIOBASE)。组织病理学检查：取左肺，石蜡切片后，常规苏木素-伊红(HE)染色，进行病理组织学检查，在BA210T显微镜(Motic)下观察并记录图像。

1.2 实验动物

8周龄SPF级C57雄性小鼠50只，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK(湘)2016-0002，实验动物使用许可证号为SYXK(湘)2012-003。体质量为18～22 g，饲养温度为20～25 ℃，饲养湿度为40%～70%。

1.3 药物提取液最大出雾浓度实验

两种药物提取液外观均为棕黄色果酱样，为探索雾化情况，均用生理盐水进行稀释，并分别用2只C57小鼠进行药物提取液雾化，烈香杜鹃提取液原液和龙胆花原液稀释至60%均可出雾，但后期雾化效果较差，可出现棕黄色果酱样沉积并堵塞雾化管；烈香杜鹃稀释至80%时出雾顺畅，龙胆花原液稀释至50%时出雾顺畅。具体操作：A.2只C57雄性小鼠，4 mL烈香杜鹃原液，雾化40 min(期间加1 mL的生理盐水稀释加大雾化量)+5 min留滞(雾化停止，雾化箱不开盖)；逐步每天5%递减烈香杜鹃提取液浓度，观察出雾情况； B.2只C57雄性小鼠，4 mL龙胆花原液，雾化40 min(期间加1 mL的生理盐水稀释加大雾化量)+10 min留滞(雾化停止，雾化箱不开盖)；逐步每天5%递减龙胆花提取液浓度，观察出雾情况。

1.4 多次雾化吸入实验

10只C57小鼠，分为3组：对照组2只，烈香杜鹃组和龙胆花组分别4只，采取多次雾化吸入实验，具体设置为：雾化吸入80%的烈香杜鹃，雾化2 h，约20 g烈香杜鹃，连续5 d；雾化吸入50%的龙胆花，雾化2 h，约4.62 g龙胆花，连续5 d；对照组正常饲养，不做任何干预。雾化结束后饲养1周，观察小鼠活动、体质量变化等一般情况，收集血清进行血生化(HGB、RBC、WBC及细胞分类、ALT、TG、BUN、CR等)相关指标的检测，取材检测肺组织形态(HE)，并称量肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏各脏器重量。

1.5 不同浓度组雾化吸入实验

C57小鼠35只，随机分为7组，每组5只，分别为对照组、烈香杜鹃低剂量组(40%)、中剂量组(60%)、高剂量组(80%)，龙胆花低剂量组(20%)、中剂量组(35%)、高剂量组(50%)。烈香杜鹃及龙胆花各组每次雾化均加入4 mL，一次雾化0.5 h，每日2次，持续给药2周(14 d)；对照组正常饲养，不做任何干预。雾化结束后饲养1周，观察小鼠活动、体质量变化等一般情况，收集血清进行血生化(HGB、RBC、WBC及细胞分类、ALT、TG、BUN、CR等)相关指标的检测，取材检测肺组织形态(HE)，并称量肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏各脏器重量。

1.6 统计学处理

采用SPSS19.0软件进行数据分析，计量资料采用配对t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 多次雾化吸入实验

2.1.1 体质量变化情况

烈香杜鹃组和龙胆花组小鼠体质量均有所增长，但与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 多次雾化吸入实验各组小鼠体质量变化情况

2.1.2 血生化指标情况

烈香杜鹃组和龙胆花组各项指标与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 多次雾化吸入实验各组小鼠血生化指标情况

2.1.3 各脏器重量情况

烈香杜鹃组和龙胆花组各脏器重量与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 多次雾化吸入实验小鼠各脏器重量情况

2.1.4 肺组织HE染色结果

烈香杜鹃雾化组较对照组肺泡间隙变小；龙胆花雾化组较对照组肺泡出现大范围断裂，且局部充血，见图1。

图1 多次雾化吸入后各组肺组织HE染色(400×)

2.2 不同浓度组雾化吸入实验

2.2.1 体质量变化情况

烈香杜鹃各剂量组和龙胆花各剂量组小鼠体质量均有所增长，但与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 不同浓度组雾化吸入实验小鼠体质量变化情况

2.2.2 血生化指标情况

烈香杜鹃各剂量组和龙胆花各剂量组中的各项生化指标与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。

表5 不同浓度组雾化吸入实验小鼠血生化指标情况

2.2.3 各脏器重量情况

烈香杜鹃组和龙胆花组各脏器重量与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表6。

表6 不同浓度组雾化吸入实验小鼠各脏器重量情况

2.2.4 肺组织HE结果

对照组气道上皮结构完整，纤毛整齐，肺泡结构正常，气道及血管周围炎性细胞浸润较少；烈香杜鹃与龙胆花各剂量组气道结构及肺泡结构正常、纤毛整齐，与对照组相比，未见明显病理损害，见图2。

注：A.对照组；B.烈香杜鹃低剂量组；C.烈香杜鹃中剂量组；D.烈香杜鹃高剂量组；E.龙胆花低剂量组；F.龙胆花中剂量组；G.龙胆花高剂量组。 图2 不同浓度雾化吸入各组肺组织HE染色(400×)

3 讨论

烈香杜鹃属杜鹃花科、杜鹃花属植物，其根茎部、叶、花均具有药理活性作用。此外，烈香杜鹃具有独特的香味,与含有大量的挥发油有关，其组成成分包括苄基丙酮(34.41%)、橙花叔醇(10.19%)、1,4-桉树脑(8.41%)、β-石竹烯(5.63%)、γ-榄香烯(5.10%)、桉油烯醇(3.06%)等[9]。研究表明，橙花叔醇具有抗炎、抗氧化、抗微生物、抗癌的效果，可通AMPK/Nrf-2/HO-1信号通路抑制脂多糖导致的急性肺损伤，也可在环磷酰胺导致的肝脏炎症、凋亡、纤维化中起保护作用[10-11]。β-石竹烯可以抗炎、抑制Toll样受体激活、激活Erk1/2和PI3K/Akt、阻断STAT3信号级联、增强AMPK磷酸化、抗凋亡等[12]。除挥发油外，黄酮类化合物是烈香杜鹃的另一主要活性成分，主要包括槲皮素、5-羟基- 6,7-二甲氧基黄酮、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、烈香杜鹃素Ⅰ、烈香杜鹃素Ⅱ，其中槲皮素是一种常见类黄酮物质，具有广泛的生物活性如抗炎、抗氧化、抗纤维化等[13-14]。

龙胆花为龙胆科龙胆属多种植物的花，主要分布于西藏、甘肃、青海等地。据《晶珠本草》记载，龙胆花对气管炎、咳嗽等疾病有治疗之效[15]。藏药“龙胆花”所含化学成分主要有裂环烯醚萜和环烯醚萜类、黄酮类、酮类、三萜类和甾体类。研究表明，环烯醚萜类龙胆苦苷具有抗炎、抗氧化、抗菌等药理作用[8]。XIE等[16]报道龙胆苦苷可显著抑制炎症因子的表达而发挥抗炎作用。

雾化吸入是将药物放入雾化装置内，将药物转变为气溶胶状态后传递至呼吸道和肺的给药方式。同口服、静脉和肌肉注射相比，有减少用药不适感及药品用量、起效快、局部用药浓度高、全身不良反应少等优点[17-18]，在呼吸系统疾病的治疗中起着举足轻重的作用。藏药雾化将藏医和现代技术相结合，已被证实确切有效且方便，目前已逐渐应用于临床[1]。本研究首次结合龙胆花、烈香杜鹃与雾化吸入，通过烈香杜鹃和龙胆花提取液探讨烈香杜鹃和龙胆花可雾化浓度及在小鼠中的急性毒理学作用。

初步探索烈香杜鹃和龙胆花的可出雾浓度，发现烈香杜鹃原液和60%的龙胆花均可用于雾化吸入，但雾化后期效果欠佳，棕黄色果酱样液体可沉积并堵塞雾化管。将浓度分别调整为80%的烈香杜鹃和50%的龙胆花后，雾化顺畅。在烈香杜鹃和龙胆花的急性毒性研究实验中，小鼠均正常生长，未见异常表现。体质量增幅，血常规和生化指标，各器官体质量与对照组相比差异无显著性(P>0.05)，显微镜下形态学观察结果未见有意义的病理学变化。为进一步探讨不同浓度对小鼠的影响，分别予以40%、60%、80%的烈香杜鹃，20%、35%、50%的龙胆花提取液雾化，发现低、中、高剂量的烈香杜鹃和龙胆花组小鼠均正常生长，体质量增幅未有明显改变。血生化指标、各器官体质量与对照组相比，差异均无显著性(P>0.05)，显微镜下形态学结果亦未见明显病理学变化。

本实验结果表明，烈香杜鹃和龙胆花提取液的最大可雾化浓度为80%和50%；烈香杜鹃和龙胆花提取液雾化安全，无明显的急性毒副作用。

综上，烈香杜鹃和龙胆花提取液的最大可雾化浓度分别为80%、50%,根据中华人民共和国卫生部《食品安全毒理学评价程序和检验方法规范》中标准，在此试验条件下雾化吸入烈香杜鹃及龙胆花提取液对试验动物机体无明显不良影响，本研究为十味龙胆花临床雾化的实施提供了理论依据。