HLA-G与肾虚血瘀型复发性流产相关性研究

曲云青，冯晓玲，谷玥儒，韩智宇

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

复发性流产(recurrent pregnancy loss，RPL)的再次发生概率将随流产次数的增加而上升，既往RPL是导致女性后续妊娠丢失的独立危险因素，除已明确的遗传因素、生殖免疫因素、生殖系统机能及结构紊乱畸形、感染等因素外，尚有部分原因不明。现代免疫生殖学认为，妊娠这一生理过程属于半同种异体移植，RPL是母胎之间免疫失去平衡协调，而致免疫排斥的反应结果，免疫机制的调节把控，对于胚胎的成功植入到最后的顺利分娩是不可或缺的，人体对外来移植物的排斥反应主要受组织相容性复合产物——MHC基因把控，HLA-G是其中之一，在母婴免疫耐受中发挥了重要的调控作用。HLA-G介导母体自身的免疫细胞和从胎儿中分化出来的绒毛外滋养层细胞(EVT)间的交互作用，于母婴界面形成特殊微环境，保证胚胎着床和正常发育。HLA-G是非经典的MHC-I分子，在生理条件下在EVT上大量且特异地表达。在孕妇血液、羊水和脐带血中也发现有可溶性HLA-G。HLA-G的异常表达和多态性与不良妊娠结局有关，例如先兆子痫(PE)以及RPL[1]。

1 HLA-G的结构及免疫调节作用

HLA-G是人类非经典主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)I类基因的一员，HLA-G于1982年首次被找到，1987年由Geraghty等克隆并测序，1990年被命名为HLA-G[2]。HLA-G的作用可促进胚胎植入子宫和血管生长发育，在母体妊娠早期适量表达，可能与维持母婴免疫微环境稳定有关联。Ia类中另一类亚型包括HLA-A、B、C三个基因位点，主要激发异体排斥反应，在妊娠初期母体的Ia类HLA沉默是必要的[3]。Morandi等[4]分析表明，与经典的I类MHC基因不同，HLA-G显示出极为有限的多样性和组织特异性较严格，发现其主要存在于母胎界面绒毛滋养层细胞、女性生殖道、卵泡液及体外培养胚胎的培养基中，可能参与胚胎着床的免疫耐受。

HLA-G似乎与怀孕特别相关。排卵后，子宫内膜的子宫基质成纤维细胞分化为蜕膜细胞，形成子宫螺旋动脉。在妊娠早期，类固醇激素、孕酮和β-雌二醇作用于孕妇的血管内皮细胞并增加血管通透性，促进血管生成[5]。免疫细胞，尤其是NK细胞通过母体血管募集。EVT侵入蜕膜并取代了内皮细胞。这些过程共同重塑螺旋动脉并形成母体——胎儿界面，以支持为胎儿发育提供氧气和营养供应。HLA-G植入前于EVT表面表达，而sHLA-G在IVF胚胎的培养基、母体血液、羊水和脐带血中被检测到[6]。HLA-G基因多态性和sHLA-G水平降低与胚胎植入失败、胎盘早剥、RPL及PE有关[7]。

Tilburgs等[8]研究发现，HLA-G与蜕膜NK细胞之间存有微弱的信号通路传导，参与调节母体NK细胞的稳定转化，为胚胎植入准备充分以及良好的内膜环境。母胎界面HLA-G是连接绒毛滋养层细胞与dNK的关键桥梁分子，绒毛滋养层HLA-G的稳定表达能有效激活母体dNK特异性转录因子同源框(PBX1)的活化，从而诱导母体表达多效生长因子(PTN)和骨甘氨酸(OGN),这些促生长因子的持续作用才能维持孕早期胎儿的稳定发育[9]。孕早期上游母胎界面HLA-G的稳定表达，能有效保证下游生长因子的功能。李婷等[10]用ELISA研究得出，妊娠期在母体血清和/或血浆中可以观察到sHLA-G水平较高，与妊娠正常组相比较，RPL组早期的sHLA-G水平显著降低。冯晓琴等[11]用qRT-PCR比较RPL组和正常妊娠终止者外周血中及绒毛中HLA-G mRNA的相对表达量，结果发现RPL组患者的外周血和流产绒毛中的HLA-G mRNA表达均显著低于正常妊娠的女性(P<0.01)，表明孕早期，若HLA-G表达下调，可能会影响胚胎侵入子宫蜕膜和重铸螺旋动脉，绒毛着床不充分，严重影响胎盘的形成。不过，Hviid[12]发现，若妊娠早期HLA-G水平过高，滋养细胞侵蚀内膜力度过强，可能将会导致滋养层细胞肿瘤发生。因此，HLA-G水平也应维持在合适范围之内，过低不利于胚胎的稳定植入以及妊娠的维持，过高将逆转它的积极效应，同样对母体产生不利影响。

HLA-G通过幼稚T细胞的分化或HLA-G从抗原提呈细胞(APCs)到T细胞上的快速转移来诱导Treg细胞转化为CD3+CD4low和CD3+CD8low抑制性T细胞，转化成为HLA-G呈显性的抑制细胞[13]。HLA-G升高了Th2抗炎性细胞因子，并降低了Th1促炎性细胞因子，而这些细胞因子在助滋养层细胞侵入及维持局部免疫抑制起着重要作用[14]。

2 HLA-G促进螺旋动脉的重塑

子宫中的胎儿发育需要母体血液提供的营养和氧气。螺旋动脉重塑对于怀孕期间加速和稳定胎盘血流至关重要。这种重塑始于蜕膜相关的重塑，并涉及螺旋动脉血管平滑肌的最初肿胀和紊乱，然后血管内皮液化并且弹性膜崩解。这些变化主要是由血管生长因子诱导的，其由蜕膜NK细胞和巨噬细胞产生[15]。NK细胞占人外周血淋巴细胞的比例不到20%，但在孕早期蜕膜中约占淋巴细胞的70%[16]。NK细胞通过表达诸如杀伤KIR来识别靶细胞上的MHC-I蛋白。然后，NK细胞根据抑制或激活受体的信号决定是否杀死靶细胞。

KIR2DL4(也称为CD158d)是KIR家族的成员，其结构、定位和功能与其他KIR有所不同[17]。 KIR2DL4是由NK细胞表达并激活IFN-g的产生，但不促进静止的外周NK细胞的毒性，KIR2DL4主要位于含有Rab5的细胞内体中[18]，这种定位需要KIR2DL4的Ig结构域。

KIR2DL4的配体是HLA-G。Rajagopalan等[19]报道可溶性KIR2DL4是由KIR2DL4的胞外区和IgG Fc区组成的融合蛋白，与表达HLA-G但不表达HLA-Cw3或HLA-B7的LCL 721.221细胞结合。此外，观察到与KIR2DL4相互作用后，靶细胞表面上的可溶性HLA-G或HLA-G被内吞到NK细胞的囊泡中。已显示可溶性HLA-G通过NK细胞可以激活促血管生成/促炎性细胞因子和趋化因子(即IL-6、IL-1b、IL-8、MIP-1-a和MIP-3-a)的分泌。 当sHLA-G或KIR2DL4激动剂抗体刺激外周血NK细胞时，DNA-PKcs被激活并诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的表达。研究表明sHLA-G可以通过与KIR2DL4结合而刺激NK细胞中衰老相关的分泌表型(SASP)的产生，从而促进血管通透性和血管生成[20]。因此，通过这种方式，HLA-G可以促进螺旋动脉重构。

据报道在静止的外周NK细胞和蜕膜NK细胞的表面上KIR2DL4的蛋白水平非常低[21]。 在外周NK细胞中证实了将sHLA-G和KIR2DL4内吞入内体并诱导促进血管渗透性的促血管生成细胞因子分泌的研究。Fu等[22]观察到孕早期蜕膜NK细胞中KIR2DL4的表达，该观察结果与KIR2DL4存在于蜕膜NK细胞的内体中的发现是一致的。

HLA-G在绒毛外滋养层细胞的表面进行的是选择性表达。Apps等[23]发现在早孕胎盘的滋养层细胞表面有相当的HLA-G表达为同型二聚体，表达同源二聚体HLA-G的LCL 721.221细胞可以刺激CD14+蜕膜巨噬细胞或NK细胞蜕膜分泌细胞因子，例如IL-6、IL-8和TNF-α。当同型二聚体HLA-G与巨噬细胞上的免疫球蛋白样转录物2(ILT2，也称为LILRB1)结合或与NK细胞上的KIR2DL4结合时，就会激活这种刺激。当被可溶性HLA-G5刺激时，从外周单核细胞分化出来的巨噬细胞可能表现出蜕膜性巨噬细胞的表型。Hanna等[24]发现蜕膜NK细胞高表达IL-8，IL-8可以结合CXCR1和CXCR3。 Transwell分析表明IL-8中和抗体可以减少蜕膜NK细胞诱导的滋养细胞的侵袭性。表达HLA-G的LCL721.221细胞可以增强妊娠妇女蜕膜NK细胞分泌更多的VEGFa，它将促进血管形成。

3 HLA-G参与了母体免疫耐受性的形成

在子宫中，胎儿既不排斥也不受到母亲免疫系统的攻击，这与母婴界面的特定免疫耐受微环境有关。在前三个月中，免疫细胞占蜕膜的40%，NK细胞、巨噬细胞和T细胞分别约占蜕膜细胞的70%、15%～20%和5%～15%[25]。胎儿来源的EVT侵入蜕膜并与母体细胞直接接触。EVT与表达受体的白细胞(如KIR)相互作用以提供免疫耐受条件[26]。

HLA-G的表达被认为可以保护NK细胞免受NK细胞系或蜕膜NK细胞的裂解。母体子宫血中的NK细胞不会杀死细胞滋养层细胞，如果同时阻断HLA-G和HLA-C的抗体添加到共培养基中，则NK细胞的细胞毒性将恢复。但是抗HLA-C抗体并未逆转针对NK裂解的保护作用。因此，HLA-G保护了胚胎来源的细胞滋养层细胞不被来自孕妇子宫血的NK细胞溶解[27]。然而，过表达HLA-G的细胞会上调HLA-E的表达，这是另一个非经典的MHC分子[28]，正是HLA-E-NKG2A /CD94相互作用抑制了NK细胞对表达HLA-G细胞系的细胞毒性。

NK细胞表达两种HLA-G受体：KIR2DL4和ILT2。NK细胞系与表达HLA-G的黑色素瘤M8细胞共培养可恢复NK细胞上KIR2DL4或ILT2的表达，并且NK细胞可利用吞噬作用从肿瘤细胞中获得HLA-G[29]。虽然未检测到HLA-G mRNA，但在NK细胞与EVT共培养后，蜕膜NK细胞中发现了细胞表面和细胞内HLA-G分子。Transwell分离表明NK细胞通过直接细胞接触获得HLA-G。因此，显示蜕膜NK细胞获得HLA-G，然后在与EVTs接触时吞噬HLA-G[8]。如上所述，HLA-G结合KIR2DL4并被NK细胞内吞。

Apps等[30]发现当与表达HLA-G的LCL 721.221细胞共培养时，蜕膜NK细胞脱粒不受影响。由于刺激表达HLA-G的LCL 721.221细胞，蜕膜NK细胞中的CD107a水平未改变。Du等[31]报道，当蜕膜NK细胞与滋养细胞预共培养时，蜕膜NK细胞对K562细胞的溶解活性降低。用Treg细胞预孵育的滋养细胞显示出更大的下调作用，这归因于蜕膜细胞中的蜕膜CD4+CD25+Treg细胞上调了HLA-G的表达。此外，针对HLA-G的中和抗体可以挽救蜕膜NK细胞的细胞毒性。因此，Treg细胞可以促进滋养细胞中HLA-G的表达并抑制蜕膜NK细胞的细胞毒性，从而促进蜕膜NK细胞产生IL-4和IL-10。足月胎盘EVT的HLA-G表达高于孕早期EVT的HLA-G表达。增加的HLA-G可以通过KIR2DL4和ILT2与足月妊娠dNK细胞提供增强的相互作用。然而，足月妊娠dNK细胞对PMA /离子霉素和K562细胞的脱颗粒能力增强。因此，在怀孕的不同阶段，HLA-G对dNK细胞的作用可能不同。

此外，发现粒细胞来源的髓样抑制细胞(GR MDSCs)在胎盘中积累[32]。孕妇外周血中的GR MDSCs表达ILT2和ILT4。可溶性HLA-G可以增强胎盘GR-MDSC对T细胞增殖的抑制活性。因此，GR-MDSCs有助于胎盘免疫耐受的形成。

4 中医学的认识

4.1 肾虚血瘀型复发性流产的病因病机

复发性流产在中医学理念中并无确切病名，根据其症状表现及临床特点可归属于妊娠病“滑胎”“数堕胎”“胎动不安”等范畴。《妇人规》云：“凡妊娠后屡有堕胎者，必因血脉气血亏损所致……况妇人之肾以系子宫胞脉，而腰为肾之外府，故胎孕之妇人最虑腰疼，痛甚则有下坠感，不可不防治之。”由此观之，肾虚导致的气血亏虚是屡孕屡堕的根本。肾为先天之本，藏蓄天癸，主导生殖，冲任督带胞络系于肾，五脏之根归于肾。男女交媾，肾气充盛则胎孕乃成，肾虚则胞胎无力维系，遂致滑胎；或因先天之精不足，化生气血乏源，五脏气血亏虚，无以养胎而堕胎；反复屡孕屡堕，冲任胞脉受损，肾所藏之阴精不足，命门之火温煦气化动力乏源，胞脉感受虚寒，血液运行阻滞则瘀血乃成。《读医随笔》曰：“阳虚，则血必凝，阴虚，故血必滞。”肾为元气之根本，肾气旺则帅血行，元气若不足则推动无力，肾虚日久必致血瘀；血行不畅，胞脉瘀阻，势必影响肾气化生和阴阳平衡，血瘀反之又可加重肾虚。冯晓玲教授[33]研究，RPL乃肾虚为根本，血瘀为标实，肾虚导致气血亏虚，故不能濡养胎元。肾虚为根本病机，血瘀则为病理基础，病性多虚实夹杂，如此循环往复，必然屡孕屡堕。

4.2 肾虚血瘀型复发性流产的辨证施治

中医强调辨证论治，临床见病患少腹、小腹疼痛不适、经行腹痛、经行不畅、经血暗红、有血块等表现，则辨为肾虚血瘀型，基于肾虚血瘀之病理基础，临证以补肾活血、化瘀通络为基本治则，攻补兼施，着重于除瘀血祛邪之时兼顾祛邪不伤正气，扶正不留邪气，以提高临床妊娠成功率。《医学衷中参西录·医方》云：“寿胎丸,治滑胎……男女生育，皆赖肾脏作强。”因此补肾固本，调理冲任气血在肾虚血瘀型复发性流产治疗中有着重要意义。方中多用仙灵脾、菟丝子、杜仲等壮补肾阳，用女贞子、墨旱莲等滋养肾阴，既可阴阳并补也可各有侧重。补肾的基础上酌加活血行瘀类中药能激发人体气血经络之功能，气血和调，阴平阳秘必然有利于两精相合。中医药特色诊疗方法对于治疗复发性流产有着显著优势，现代众多妇科医家多采用中西医结合疗法诊治，疗效也十分显著。冯晓玲教授据多年临床经验自拟补肾活血方(菟丝子15 g,丹参15 g,黄芪15 g,桑寄生15 g,续断15 g,阿胶10 g)，同时加用激素周期疗法对于复发性流产诊治疗效颇为显著。

肾乃先天之本原，元气之根基，肾藏精气主生殖，若先天禀赋亏虚，导致子宫内膜容受性下降，进而肾虚胎元不固有欲堕之趋势，则发为胎动不安、胎漏。现代研究认为免疫力不强是许多疾病发生的因素之一。而免疫力在中医学中则为正气，正可谓“正气存内，邪不可干”。故肾气的强盛与衰弱决定了人体中正气的强弱，决定了是否可以抵抗病邪，即现代研究中的“肾虚与免疫力”的理论基础[34]。多项研究已经发现，中药通过HLA-G、LIF、VEGF等细胞因子可干预母婴免疫调节机制，其调节路径是多靶点的[35]。研究发现，左归丸与资冲颗粒(菟丝子、枸杞子、山萸肉、山药、熟地黄、鹿角胶)都可增加滋养细胞组织HLA-G的表达，进而诱导母婴免疫微环境的形成；齐丹等[36]研究表明，补肾安胎方(黄芩10 g，党参10 g，白芍10 g，白术10 g，菟丝子12 g，续断12 g，槲寄生10 g，山药10 g)可通过上调HLA-G的表达，从而维持母婴免疫平衡。随着中医学的大力发展，中西结合治疗复发性流产有望成为未来的首选方式。

5 结语

妊娠类似器官移植，是特殊免疫状态，妊娠的维持依赖于母婴免疫界面耐受平衡，一旦平衡失调，胎儿将被母体排斥，导致妊娠失败。HLA-G在维持母胎免疫平衡的过程中起到关键调控作用，需维持在一个合适的范围之内，若其表达失衡则不利于胚胎的种植和妊娠的稳定，可能会引起母体免疫系统对胎儿排斥反应而导致流产的发生。中医学认为，“若因母病而致胎动，则治其母，若因胎动而母病，但安其胎”(《妇人规·胎动欲堕》)，肾虚血瘀型是复发性流产的常见证型，研究证实补肾活血安胎法干预HLA-G介导的母胎免疫失衡所致复发性流产具有显著功效，审证求因治本，辨证论治，从而改善了生殖内分泌功能和免疫平衡，并提高了子宫内膜的容受性。开展更多的HLA-G基因及免疫调节等方面的研究，进一步研究HLA-G对RPL的影响，有利于提高妊娠成功率。