诺丽对氢化可的松致肾阳虚模型小鼠改善记忆的作用机制研究

张睿，邸松蕊，余淑惠，刘金莲，汤如莹，葛东宇，董瑞娟，张建军

(北京中医药大学，北京 100029)

诺丽(Noni)原产于波利尼西亚群岛，为茜草科海滨木巴戟(MorindacitrifoliaL.)的果实，广泛分布于太平洋南部诸岛和中南半岛地区，当地人应用其强身健体治疗各种疾病[1]，现代研究表明其具有强大的抗氧化能力[2]。目前诺丽已合法引入中国使用，国内市场已出现诺丽与人参配伍，诺丽与黄精配伍，诺丽与山茱萸、女贞子配伍等产品。在专利网站进行检索，截至2021年5月共有407条诺丽相关专利，其中不乏与中药配伍之品。有学者对南美草药阿萨伊等一系列外来药物进行了中药药性探讨[3]，并明确了新外来中药的概念[4]，提出了外来药物“中药化”的研究策略[5]。为使诺丽在我国更好地推广应用，也为使其与中药合理配伍，依据新外来中药现代研究范式[6]，刘金莲等[7]对诺丽文献进行全面整理并首次进行系统的中医药理论分析，提出了诺丽的药性为酸、甘、平,归肝、肾、脾经，具有滋补肝肾、强筋健骨、益气养阴之效。有研究表明诺丽可改善记忆[8]，但其作用机制尚不明确。本研究旨在通过观察诺丽对氢化可的松致肾阳虚模型记忆损伤小鼠行为学、病理、神经递质和cAMP/PKA通路蛋白的影响，揭示诺丽补肾改善记忆的作用机制，为诺丽归肾经及补肾功效提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF雄性昆明小鼠60只，体质量(20±2)g，购自斯贝福(北京)实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0002。饲养于北京中医药大学SPF级动物房，小鼠自由摄食和饮水。实验符合相关伦理学要求。

1.2 药物

诺丽干粉(美国大溪地诺丽公司，批号：US20180321)，人参配方颗粒(北京康仁堂药业有限公司，批号：18006312)，氢化可的松注射液(天津金耀药业有限公司，批号：1801181)。

1.3 试剂

环磷酸腺苷(cAMP)试剂盒、环磷酸鸟苷(cGMP)、磷酸激酶A(PKA)ELISA试剂盒(北京华英生物技术研究所，批号：20190812，20190815，20190823)；乙酰胆碱(ACh)、5羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上素(NA)ELISA试剂盒(江苏科特生物科技有限公司，批号：MB3256B，MB3179B，MB3092B，MB3269B)。

1.4 主要仪器

Epoch2C型酶标仪(美国BioTek)，SleeMPS/P2型包埋机(德国SLEE)，RM2245型切片机(德国Leica)，全自动切片扫描仪Axio Scan.Z1(德国ZEISS)。

1.5 方法

1.5.1 分组与给药

小鼠适应性喂养3 d后随机分为6组，每组10只，即对照组,模型组,人参组(1.00 g/kg，相当于成人剂量6 g/d),诺丽高、中、低剂量组(1.33、0.67、0.33 g/kg，分别相当于成人剂量8、4、2 g/d)。从实验开始第1天，每天除对照组、模型组灌胃双蒸水外，其余各组每天下午灌胃相应药物，连续14 d，灌胃容量为0.01 mL/g。

1.5.2 造模

除对照组外，其余5组每天上午灌胃氢化可的松(25 mg/kg)造成记忆损害模型，对照组灌胃生理盐水，连续14 d[9-10]。

1.6 检测指标

测量实验第7天、第14天体质量及大脑指数(Brain Index，BI=大脑质量÷体质量×100%)；第10天和第14天行为学检测跳台实验和避暗实验的潜伏期，3 min的错误次数，消退测验潜伏期，消退测验3 min的错误次数；大脑尼氏染色(苯胺蓝染液)，观察椎体细胞形态，检测尼氏体数量(运用Image pro plus 5.1进行形态计量)；ELISA检测ACh、5-HT、DA、NA、cAMP、cGMP、PKA含量。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠一般状态、体质量、脑指数比较

实验期间，各组小鼠活动正常，毛色正常，造模和用药后，体质量总体减轻，脑指数增加，但差异均无统计学意义(P>0.05)，氢化可的松、诺丽、人参均不会对体质量和脑指数产生影响，结果见表1。

表1 各组小鼠体质量和脑指数的比较

2.2 小鼠记忆行为学比较

与对照组比较，模型组跳台测验和避暗实验潜伏期显著缩短(P<0.01)，测验错误次数显著增加(P<0.01)，说明造模成功。与模型组相比，人参组和诺丽高、中剂量组的潜伏期和消退潜伏期明显延长(P<0.01，P<0.05)，错误次数和消退错误次数也明显减少(P<0.01，P<0.05)。诺丽高剂量组的疗效与人参组相近，结果见表2、表3。

表2 小鼠跳台实验结果

表3 小鼠避暗实验结果

2.3 小鼠大脑海马尼氏体表达情况

对照组小鼠海马CA3区神经椎体细胞排列紧凑和整齐，尼氏体丰富，且未有明显的尼氏体深染或固缩。与对照组比较，模型组小鼠海马CA3区尼氏体数量显著减少(P<0.01)，细胞排列疏松，且有明显的椎体细胞深染或固缩。与模型组相比，各给药组小鼠海马CA3区尼氏体数量显著增加(P<0.01)，细胞排列稍紧凑，且椎体细胞深染和固缩减轻。结果见图1，表4。

图1 各组小鼠大脑尼氏染色(×10,×100)

表4 100倍光镜下各组小鼠大脑CA3区尼氏体数量

2.4 小鼠大脑中ACh、5-HT、DA、NA含量比较

与对照组相比，模型组4种神经递质含量均明显下降(P<0.01，P<0.05)，与模型组相比,人参组和诺丽高、中剂量组可明显回升4种神经递质含量(P<0.01，P<0.05)，结果见表5。

表5 各组小鼠大脑神经递质含量

2.5 小鼠大脑中cAMP、cGMP、PKA含量比较

与对照组相比，模型组cAMP、cGMP、PKA含量、cAMP/cGMP明显下降(P<0.01)，与模型组相比,人参组，诺丽高、中、低剂量组均可明显回升cAMP、cGMP、PKA含量、提升cAMP/cGMP比值(P<0.01，P<0.05)，结果见表6。

表6 小鼠大脑中cAMP、cGMP、PKA含量、

3 讨论

随着社会老龄化的发展趋势，记忆减退逐渐成为了严重的社会和医学问题，阿尔兹海默病的主要特征是记忆减退。据估计,到2030年，全球将有1.35亿人患有阿尔兹海默病[11]。目前仍未发现有效的途径能从根本上治疗记忆减退。对现存改善记忆的中成药和中药类保健食品进行数据挖掘和特点分析发现，改善记忆产品用药多归肾经[12]。中医理论认为记忆减退与肾密切相关，肾藏精主骨生髓，脑为髓海，脑为元神之府，肾中精气亏虚，记忆力下降；肾中精气充足，脑髓得养，则记忆力增强。GEORGIEVA-KOTETAROVA等[13]在记忆行为学方面观察到诺丽可改善由地西泮诱导的痴呆大鼠模型，能够有效防治记忆减退。本实验重点研究其归肾经补肾改善记忆的功效和作用机制。

肾精亏耗产生的阴阳气血失调是衰老和记忆减退的重要原因，当阴阳平衡遭到破坏，人体机能稳态就会发生破坏导致衰老和记忆减退。诺丽性平补肾，平补阴阳，即在肾精亏虚阴阳虚损的情况下，通过既补肾阴又补肾阳调节机体平衡，达到延缓衰老，改善记忆的目的，符合平性药“条件显性，双向适用”的作用特点[14]。氢化可的松致肾阳虚模型是最早建立的中医模型之一[15]，之后学者相继用腺嘌呤法、频繁交配法、甲状腺切除法模拟肾阳虚，为肾阳虚模型的研究奠定了基础。沈自尹[16]提出肾阳虚与现代医学的神经内分泌免疫系统有关，肾阳虚证在下丘脑-垂体-靶腺轴不同环节、不同程度的功能紊乱，在建立肾阳虚证动物模型方面取得了较大突破。氢化可的松为外源性糖皮质激素，当摄入大量外源性糖皮质激素后垂体分泌的促肾上腺皮质激素受到抑制，导致肾上腺皮质激素分泌减少，肾上腺萎缩，使模型动物出现一系列“耗竭”现象，符合中医肾阳虚证的临床表现。皋聪等[10]用氢化可的松建立肾阳虚记忆障碍小鼠模型，研究补肾填精对记忆的改善作用。在补肾阳本质的研究中发现，肾阳虚机体免疫功能总体水平低下，cAMP/cGMP比值下降是肾阳虚发病的重要物质基础，应用药物使cAMP/cGMP升高，可表示该药物可补肾阳[17]。依据同类比较原则，阳性药选择性温、大补元气、归肾经[18]、有明确改善记忆作用[19]的人参。人参性温可温补肾阳，大补元气，元气是人体各项生命活动的基础，是脑部生理功能的根本；元气充沛，则脑清神明；元气亏虚，则髓海失养，记忆减退。本实验模型组cAMP/cGMP降低，用药后cAMP/cGMP升高，诺丽和人参均表现出补肾阳的趋势。

PACHAURI等[20]应用东莨菪碱诱导的记忆损伤模型，观察到诺丽可增加避暗实验的潜伏时间，增加乙酰胆碱酯酶的活性、提升谷胱甘肽活性、清除丙二醛。本研究避暗实验及跳台实验结果均说明氢化可的松造模后，小鼠存在严重的认知障碍。给予人参或诺丽后其记忆行为得到改善，说明人参或诺丽可改善对小鼠的认知能力。诺丽高剂量改善小鼠认知障碍的效果最好，且效果与人参相当。病理观察小鼠大脑海马CA3区椎体细胞和尼氏体数量。椎体细胞是参与信息传递局部微环路的中间神经元，尼氏体为神经元细胞器合成和更新提供结构蛋白，常作为神经元功能状态的标志[21]，尼氏体多而大表明神经细胞合成蛋白质的功能较强，突触为接受信号和传递信号的关键结构，其形态结构和功能的改变均会影响学习记忆[22]。因此抑制神经元丢失和改善突触的形态及其功能可能对海马依赖性学习记忆具有一定的意义。尼氏染色结果说明模型组小鼠存有明显的神经元丢失和尼氏体损伤。给予人参或诺丽后，椎体细胞深染固缩减轻，表明人参和诺丽可以抑制小鼠神经元丢失。

ACh属于中枢胆碱能系统，在记忆调节中起着重要作用[23]。5-HT是中枢神经系统中与学习和记忆密切相关的递质[24]。DA参与学习、记忆和注意力等各种认知过程[25]。NA对记忆的准确性和泛化产生相反的影响，通过对记忆的时间依赖性重组的系统巩固过程产生不同的影响。NA增强基底外侧杏仁核-海马连通性来提高记忆准确性，从而产生持久的海马依赖性情节性记忆[26]。造模后，4种神经递质均明显减少，而应用人参或诺丽后，神经递质含量均得到恢复。说明诺丽可以调控记忆损伤情况下的脑内神经递质。

cAMP作为细胞内传递信息的第二信使，主要由腺苷酸环化酶催化三磷酸腺苷而来，容易被细胞内磷酸二酯酶水解。因此，神经细胞内的水平，是由磷酸二酯酶和腺苷酸环化酶二者功能状态决定的。cAMP的升高可增强突触前神经递质的释放，其作用可能是直接的，也可能是通过激活PKA来实现。研究表明，cAMP/PKA信号通路在蛋白合成依赖性时相中起重要作用，可以经由磷酸化转录因子反应元件启动通路下游基因的转录，还能够磷酸化通道结构亚基而改变其功效，从而调节神经细胞内钙离子水平和钙信号转导。cAMP/PKA信号通路从多个方面改善神经元内在生长状态影响轴突生长，促进轴突的再生[27]。PKA磷酸化代谢过程中的一些靶蛋白中的丝氨酸或者苏氨酸残基，将其激活或活化[28-29]。这些被磷酸化的蛋白是关键性的调节酶、功能重要的蛋白质或者转录因子，因此可以介导细胞外信号调节的代谢、基因转录等细胞的效应。通过对底物蛋白的磷酸化而参与其下游受体的基因表达、突触功能等的调控、神经活性物质的释放与合成。神经元和突触为海马依赖性学习记忆的生物学基础[30]，其下游释放的神经活性物质包括Ach、5-HT、DA、NA等。诺丽可以提升cAMP、PKA含量进而促使脑内神经递质释放。

综上所述，肾生髓通脑，诺丽补肾可改善氢化可的松致肾阳虚的记忆损伤，其机制可通过调节脑内cAMP/PKA通路蛋白，影响下游神经递质含量，促进神经元蛋白合成而实现。本研究为探讨诺丽中药药性、指导临床配伍应用及阐明改善记忆机制提供实验依据。诺丽的中药药性仍有待在实践中不断验证与完善。