沉默长链非编码RNA FAM83H-AS1提高肺腺癌细胞的化学治疗敏感性

郭家辰，徐然

（中国医科大学附属盛京医院 1.检验科；2.胸外科，沈阳 110004）

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率和致死率均居首位。其中，肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD） 的发病率呈明显上升趋势，在许多国家已超过鳞状细胞癌成为最常见的肺癌组织学类型［1］。手术切除配合放射化学治疗是目前治疗LUAD的主要手段。中华医学会肺癌临床诊疗指南对LUAD的一线治疗方案之一为培美曲塞和铂类药物（如顺铂） 的联合治疗。化学治疗（简称化疗） 能明显改善LUAD患者的预后，但化疗耐药严重限制了化疗的临床应用。因此，研究并发现提高LUAD化疗敏感性的方法非常重要。

近年来，许多非编码RNA，特别是长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA） 被证明参与了包括LUAD在内的几乎所有类型肿瘤化疗耐药的发生和维持［2-3］。FAM83H-AS1基因位于8q24.3，由于缺乏蛋白质编码能力，属于lncRNA。目前，已有多篇文献［4-5］报道FAM83H-AS1在胃癌、前列腺癌等肿瘤中的存在表达和功能异常。WANG等［6］报道FAM83HAS1高表达与LUAD患者预后不良相关，且能够促进LUAD的恶性进展并抑制细胞凋亡。然而，FAM83HAS1在LUAD化疗耐药中的作用尚不清楚。

本研究发现FAM83H-AS1与LUAD化疗（培美曲塞和顺铂） 耐药相关，能通过调控多药耐药相关基因ATP结合盒亚家族C成员1（ATP binding cassette subfamily C member 1，ABCC1） 促进LUAD化疗耐药。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：104例LUAD及相应的正常肺组织（normal lung tissue，NLT） 标本均经支气管镜活检或经皮肺活检获得，并由2名病理学家诊断为LUAD。本研究获得本院伦理委员会批准，所有患者均签署书面知情同意书。本研究包括男37例，女67例，年龄35～79岁，中位年龄为62.9岁。纳入标准：所有患者均确诊为LUAD，在确诊前未接受治疗。排除标准：患者病例信息不完整，或患有其他疾病。

确诊后，57例LUAD患者选择新辅助化疗或姑息化疗（培美曲塞和顺铂）。化疗2～3个疗程后复查胸部增强CT及血清肿瘤标志物。根据病灶大小及血清肿瘤标志物水平的变化，将患者分为敏感组（39例） 和不敏感组（18例）。

人肺动脉内皮细胞（pulmonary artery endothelial cells，PAEC） 购自武汉云克隆公司，肺腺癌细胞系（PC9和A549） 购自宁波明舟公司；多药耐药细胞系A549/CR为本课题组前期构建［7］。

1.1.2 主要试剂：培美曲塞和顺铂购自美国Sigmaaldrich公司；SYBR RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司；TRIzol和Lipofectamine 3000购自美国赛默飞公司；FAM83H-AS1抑制剂（sh-FAM83H-AS1） 及阴性对照（sh-NC） 购自广州锐博公司；CCK8试剂盒购自上海碧云天公司；ABCC1和GAPDH抗体购自武汉云克隆公司。

1.2 方法

1.2.1 实时定量PCR：TRIzol法从组织或细胞标本中提取总RNA，检测RNA的纯度和完整性。应用一步法SYBR RT-PCR试剂盒扩增FAM83H-AS1基因，按照说明书设定反应条件。引物序列见表1。反应体系和反应条件参照说明书。根据内参基因GAPDH的表达进行归一化后，应用比较Ct值法计算FAM83H-AS1的相对表达量，并基于相对表达量的平均值，将所有LUAD患者分为高表达组和低表达组。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.2 细胞培养及转染：所有细胞系均应用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于5% CO2，37 ℃的条件下培养。将5×104个A549/CR细胞接种于6孔板中，培养24 h。按照说明书，应用Lipofectamine 3000将FAM83H-AS1抑制剂转染入A549/CR细胞，培养5～6 h，更换培养基后继续常规培养。

1.2.3 药物敏感性检测：分别用培美曲塞（0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL和50 μg/mL）和顺铂（5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL和75 μg/mL） 处理A549/CR细胞。然后，按照说明书使用CCK8试剂盒检测细胞活力。酶标仪检测每个样本的吸光度（450 nm），并计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.4 Western blotting：提取A549/CR细胞总蛋白，进行蛋白定量分析。取样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到聚偏二氟乙烯膜上，4 ℃过夜封闭，与一抗（ABCC1抗体） 杂交，二抗孵育，化学发光，凝胶成像仪获取图像。利用Image J软件对图像中的条带进行分析。

1.3 统计学分析

采用Graphpad prism 5软件分析数据。每组实验重复5次，数据以±s表示。差异比较采用单因素方差分析、t检验和χ2检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FAM83H-AS1在LUAD中高表达

与NLT组织相比，LUAD组织中FAM83H-AS1的相对表达量显著上调（图1A，P＜ 0.001）。与PAEC细胞相比，在PC9和A549细胞中FAM83H-AS1的相对表达量明显增加（图1B，P＜ 0.001）。

LUAD组织中FAM83H-AS1的表达与患者的吸烟史和化疗（培美曲塞和顺铂） 不敏感相关（P＜ 0.05），与年龄、性别和TNM分期无相关性（P＞ 0.05）。见表2。基于癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库的预后分析结果显示，与FAM83H-AS1低表达的LUAD患者相比，FAM83H-AS1高表达的LUAD患者的生存时间更短，预后更差（图1C，P＜ 0.05）。

表2 104例LUAD患者的FAM83H-AS1表达与临床病理信息的相关性Tab.2 Correlation between FAM83H-AS1 expression and clinical pathological characteristics of 104 LUAD patients

图1 FAM83H-AS1在LUAD中高表达Fig.1 High expression of FAM83H-AS1 in LUAD

2.2 FAM83H-AS1高表达与LUAD化疗不敏感相关

与化疗敏感组LUAD组织相比，不敏感组LUAD组织中FAM83H-AS1的表达显著增加（图2A，P＜0.05）。如图2B和2C所示，A549细胞对培美曲塞和顺铂的IC50分别为（2.17±0.58） μg/mL和（10.86±1.97）μg/mL，而A549/CR细胞对培美曲塞和顺铂的IC50分别 为（13.48±1.37） μg/mL和（48.72±3.85） μg/mL。A549/CR细胞对培美曲塞和顺铂的耐药系数分别为6.21和4.49，其表现出对培美曲塞和顺铂较强的耐受性。而且，与A549细胞相比，A549/CR细胞中FAM83H-AS1的表达显著上调（图2D，P＜ 0.05）。

图2 FAM83H-AS1高表达与LUAD患者的化疗不敏感相关Fig.2 High-expression of FAM83H-AS1 is related with insensitivity to chemotherapy in LUAD

2.3 沉默FAM83H-AS1提高A549/CR细胞对培美曲塞和顺铂的敏感性

实时定量PCR检测证实转染sh-FAM83H-AS1能够显著降低A549/CR细胞中FAM83H-AS1的表达（图3A，P＜ 0.05）。与对照组相比，FAM83H-AS1沉默将A549/CR细胞对培美曲塞的IC50由（14.13±1.33） μg/mL降为（6.71±0.75） μg/mL（图3B，P＜ 0.05），将对顺铂的IC50由（48.21±4.27） μg/mL降为（20.16±2.57） μg/mL（图3C，P＜ 0.05）。沉默FAM83H-AS1提高了A549/CR细胞对培美曲塞和顺铂的敏感性。

图3 沉默FAM83H-AS1提高A549/CR细胞对培美曲塞和顺铂的敏感性Fig.3 Silencing of FAM83H-AS1 enhances pemetrexed and cisplatin sensitivity of A549/CR cells

2.4 沉默FAM83H-AS1降低A549/CR细胞中的ABCC1蛋白的表达水平

基于TCGA的数据库，应用生物信息学软件GEPIA2进行基因表达相关性分析。结果显示，FAM83HAS1与ABCC1基因的表达在LUAD中呈正相关（图4A，P＜ 0.01）。而且，沉默FAM83H-AS1能够抑制A549/CR细胞中ABCC1蛋白的表达（图4B，P＜ 0.05）。

图4 沉默FAM83H-AS1降低A549/CR细胞中的ABCC1蛋白的表达水平Fig.4 Silencing of FAM83H-AS1 decreases ABCC1 protein expression level in A549/CR cells

3 讨论

近年来，诸多肿瘤学研究证实非编码RNA参与了包括LUAD在内的多种肿瘤化疗耐药的发生和维持。尤其是lncRNAs，因其数量众多、功能和机制复杂等特点，引起研究者的广泛关注。例如，SLCO4A1-AS1通 过miR-4701-5p/NFE2L1途径激活WNT通路，促进LUAD细胞的生长并诱导其对顺铂的耐药［8］；LINC00485作为分子海绵结合microRNA-195调节其靶基因CHEK1，进而降低LUAD细胞对顺铂的化疗敏感性［9］。

本研究结果显示，FAM83H-AS1在LUAD中高表达。FAM83H-AS1的异常高表达与LUAD患者吸烟史及化疗不敏感有关，而且其高表达与LUAD患者的不良预后相关。这些提示FAM83H-AS1参与了LUAD的化疗耐药，可能发挥癌基因的作用。

本研究还发现FAM83H-AS1在化疗（培美曲塞和顺铂） 不敏感的LUAD组织和细胞系中高表达，而且FAM83H-AS1的沉默显著提升了化疗耐药细胞株A549/CR对培美曲塞和顺铂的敏感性。进一步证明了FAM83H-AS1参与了LUAD的化疗耐药。

生物信息学分析结果显示，LUAD中FAM83HAS1与ABCC1基因的表达正相关。而且，沉默FAM83H-AS1能够抑制A549/CR细胞中ABCC1蛋白的表达。ABCC1是一个经典的多药耐药相关基因，属于ATP结合盒转运蛋白超家族。ABCC1蛋白介导物质进出细胞，能在化疗药物起效前将其排出细胞外。诸多研究［10-11］证实ABCC1参与了几乎所有恶性肿瘤的化疗耐药的发生，包括LUAD。据此，本研究认为FAM83H-AS1能够通过正性调节ABCC1基因，促进化疗药物从细胞中排出，导致LUAD化疗耐药的发生。

综上，FAM83H-AS1在LUAD中高表达，且与LUAD患者的化疗不敏感相关，FAM83H-AS1能通过正性调节ABCC1基因，参与LUAD化疗耐药的形成。本研究有助于明确LUAD化疗耐药发生的分子机制，亦能够为LUAD的临床综合治疗提供新靶点。