气相色谱-串联质谱法测定中药材中35 种农药残留的样品处理方法

王红梅，石青，王晨，郭贝，郑莉

（湖北省普林标准技术服务有限公司，武汉 430050）

中医药是我国医药卫生的重要组成部分，具有悠久的历史传统，是中华民族智慧的结晶，其独特的治疗理念已逐渐被其它国家所接受。目前我国常用的植物源中药材有600 多种［1-2］，每年有大量中药材出口到包括美国、日本在内的近100 个国家和地区［3-4］。由于人类对中药材需求量较大，野生中药材资源日渐匮乏，人工种植中药材成为中药材市场的主流。为了控制病虫害，提高中药材产量和质量，农药的使用量逐渐增加。另外，种植基地的大气、土壤及灌溉水质量等均是导致中药材中农药残留的重要因素［5］。近年来，中药材中农药的检出率呈现上升趋势。何清彦等［6］考察了10 种30 批药食两用药材中有机氯的残留量，检出率为100%；郑双双等［7］以《欧洲药典》为标准，对金银花、泽泻和川芎中11种有机磷农药残留量进行了检测，发现金银花、泽泻和川芎的不合格率分别为60%、40%和10%；王莹等［8］调查了枸杞中拟除虫菊酯类农药残留情况，发现氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯和氯氟氰菊酯4 种中等毒性的农药检出率均超过25%，其中氰戊菊酯的检出率高达75%，因此建立高效、精准的中药材中农药残留的检测方法势在必行。

测定农药残留的方法主要有气相色谱法、液相色谱法、色谱-串联质谱法等［9］。气相色谱法主要是根据待测农药的结构及其所含元素的不同，选择相应的检测器，不适合对多种不同类型农药的同时检测。液相色谱法适用于不易挥发、热不稳定化合物的分析，此法分离效率高、分析速度快，但是液相色谱检测器不能准确检测化合物结构，主要依赖于色谱柱的分离度来定性，不适合多种农药残留高通道同时检测［10］。色谱-质谱联用技术具有灵敏度高、准确性好、特异性强等优势。气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）法作为一种典型的色谱-质谱联用技术，可对难以区分的热稳定好且易挥发的同分异构体进行分离鉴定，可根据农药分子的特征离子碎片，准确鉴别未知农药化合物，适合多组分农药的同时检测。

常用的中药材样品处理方法有固相萃取法、基于QuEChERS 原则的处理方法、凝胶渗透色谱法、加速溶剂萃取法等［11］。凝胶渗透色谱法和加速溶剂萃取法能准确分离农药残留组分，减少基质干扰，但需要消耗大量溶剂和标准品，操作繁琐且易造成二次污染；固相萃取法在一定程度上对样品能起到净化作用，但是对于多种农药同时分析时难以保证所有农药回收率均较佳；基于QuEChERS 原则的处理方法提取过程较繁琐［12］，而且盐包中的硫酸镁溶解时会放出大量的热量，影响热不稳定农药的测定结果，因此不同样品处理方法各有优势，但也同时存在缺点和局限性。

目前中药材中农药残留检测主要面临两方面问题。一方面是中药材品种繁多，而且每种中药材成分的理化性能差异较大，难以建立一种统一的样品处理方法，甚至对于一些基质特殊的中药材还没有摸索出适合的样品处理方法；另一方面是农药品种多样，物理化学性质差异较大，在药材中残留量较低，一般为痕量级，且中药材中部分成分的理化性能与农药成分相似，导致农药残留的提取和净化难度增大［13-14］。笔者以气相-串联质谱法为检测手段，对200 种中药材中35 种农药检测时的样品处理方法进行了梳理，比较分析了基于QuEChERS 原则的处理方法、石墨化碳黑氨基复合固相萃取（GCBNH2）法和亲水亲油平衡材料固相萃取（HLB）法3种样品处理方法的优缺点，优化了不同类型中药材的样品处理方案，为今后中药材检测提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱-三重四级杆质谱仪：7890B-7010B GC/TQ 型，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：XS105DU 型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多集团。

全自动均质器：AH-50 型，睿科集团股份有限公司。

高通道真空平行浓缩仪：MPE 型，睿科集团股份有限公司。

高通道全自动固相萃取仪：FS 360 型，睿科集团股份有限公司。

可调式混匀仪：MX-S 型，大龙兴创实验室仪器（北京）股份公司。

35 种农药混合标准溶液：编号为CDAA-M-490405-TZ-1ML，各农药质量浓度见表1，上海安谱实验科技股份有限公司。

表1 35 种农药混合标准溶液中各农药质量浓度

甲苯、乙腈：均为色谱级，上海安谱实验科技股份有限公司。

氯化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

基质固相分散材料（MSPD）、亲水亲油平衡材料固相萃取小柱（HLB）和石墨化碳黑氨基复合固相萃取小柱（GCB-NH2）：上海安谱实验科技股份有限公司。

金银花样品：客户送检。

1.2 样品处理

1.2.1 基于QuEChERS 原则的处理方法

准确称取3.00 g 金银花粉末（过三号筛）于50 mL 离心管中，加入1%乙酸溶液15 mL，涡旋，使药粉充分浸润，静置30 min，加入15 mL 乙腈，涡旋，混匀，置于振荡器中以500 次/分的频率震荡5 min，加入无水硫酸镁与无水硫酸钠的混合粉末（质量比为4∶1）7.5 g，立即摇散，置于振荡器中以500次/分的频率震荡3 min，于冰浴中冷却10 min，以4 000 r/min 转速离心5 min，取上清液9 mL，置于预先装有净化材料（无水硫酸镁900 mg，N-丙基乙二胺300 mg，十八烷基硅烷键合硅胶300 mg，硅胶300 mg，石墨化炭黑90 mg）的分散固相萃取净化管中涡旋，混匀，置于振荡器中以500 次/分的频率震荡5 min，精密吸取上清液5 mL，置于氮吹仪上浓缩至0.4 mL，加入乙腈稀释至2.0 mL，涡旋混匀，滤过得样品处理液。将上述样品处理液过0.22 μm 有机相滤膜，取1.0 mL，加入0.01 mL乙腈，混匀，待测。

1.2.2 HLB 法

准确称取5.00 g 金银花粉末（过三号筛）于100 mL 离心管中，加入1 g 氯化钠，立即摇散，再加入50 mL 乙腈，以不低于12 000 r/min 转速匀浆处理2 min，然后离心，取上清液。沉淀物中加入50 mL 乙腈重复操作，合并两次提取液，减压浓缩至约3～5 mL，用乙腈稀释至10.0 mL，摇匀即得提取液。移取上述提取液3 mL，通过亲水亲油平衡材料固相萃取柱（HLB）（200 mg，6 mL）净化，收集全部净化液，混匀，即得样品处理液。将上述样品处理液过0.22 μm 有机相滤膜，取1.0 mL，加入0.01 mL 乙腈，混匀，待测。

1.2.3 GCB-NH2法

提取液制备方法同1.2.2。移取2 mL 提取液，加入装有石墨化碳黑氨基复合固相萃取小柱（500 mg/500 mg，6 mL）［临用前用乙腈-甲苯混合溶液（体积比为3∶1）10 mL 预洗］，用20 mL 乙腈-甲苯混合溶液（体积比为3∶1）洗脱，搜集洗脱液，减压浓缩至近干，用乙腈转移并稀释至2.0 mL，混匀，即得样品处理液。将上述样品处理液过0.22 μm 有机相滤膜，取1.0 mL，加入0.01 mL乙腈，混匀，待测。

1.3 溶液配制

35 种农药混合标准储备液：移取35 种农药混合标准溶液0.05 mL，置于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至标线，混匀。其中α-六六六、γ-六六六、β-六六六、δ-六六六、艾氏剂、水胺硫磷、α-硫丹、狄氏剂、4，4′-滴滴伊、除草醚、2，4′-滴滴涕、4，4′-滴滴滴、4，4′-滴滴涕、β-硫丹、硫丹硫酸酯、蝇毒磷的质量浓度均为0.5 μg/mL，p，p′-三氯杀螨醇的质量浓度为0.4 μg/mL，久效磷、甲基硫环磷的质量浓度均为0.3 μg/mL，内吸磷-O、内吸磷-S、灭线磷、杀虫脒、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、氟甲腈、甲基对硫磷、氟虫腈亚砜、氟虫腈、对硫磷、甲基异柳磷、氟虫腈砜、苯线磷的质量浓度均为0.2 μg/mL，o，p′-三氯杀螨醇的质量浓度为0.1 μg/mL。

基质匹配标准工作溶液：取金银花空白基质样品，分别按照1.2.1、1.2.2 和1.2.3 方法进行处理。取1.0 mL 样品提取液，各6 份，氮气吹干，分别加入35 种农药混合标准储备液0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2 mL，用乙腈定容至1.0 mL，混匀。其中α-六六六、γ-六六六、β-六六六、δ-六六六、艾氏剂、水胺硫磷、α-硫丹、狄氏剂、4，4′-滴滴伊、除草醚、2，4′-滴滴涕、4，4′-滴滴滴、4，4′-滴滴涕、β-硫丹、硫丹硫酸酯、蝇毒磷的质量浓度均分别为5、10、25、50、75、100 μg/L，p，p′-三氯杀螨醇的质量浓度分别为4、8、20、40、60、80 μg/L，久效磷、甲基硫环磷的质量浓度均分别为3、6、15、30、45、60 μg/L，内吸磷-O、内吸磷-S、灭线磷、杀虫脒、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、氟甲腈、甲基对硫磷、氟虫腈亚砜、氟虫腈、对硫磷、甲基异柳磷、氟虫腈砜、苯线磷的质量浓度均分别为2、4、10、20、30、40 μg/L，o，p′-三氯杀螨醇的质量浓度分别为1、2、5、10、15、20 μg/L。

1.4 共萃取基质的测定

用“质量测定”方法［15］考察3 种样品处理方法得到的提取液中共萃取基质的含量，即取空白样品，经乙腈提取后未净化的萃取液为初级萃取液，经不同样品处理方法净化后的萃取液为最终净化液，分别将2 mL 最终净化液置于已称重的洁净试管中，氮气吹干后于110 ℃烘箱中干燥至恒重，取出冷却并称重，与原试管质量差即为共萃取基质的含量。

1.5 仪器工作条件

1.5.1 色谱

色谱柱：VF-17 ms 弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司）；进样口温度：250 ℃；进样方式：不分流进样；不分流时间：1 min；载气：氦气，纯度（体积分数）为99.999%；恒压模式，柱前压力为146 kPa；程序升温：初始温度为60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min 升温至120 ℃，然后以10 ℃/min 的速率升温至160℃，再以2 ℃/min 的速率升温至230 ℃，最后以15℃/min 的速率升温至300 ℃，保持6 min。

1.5.2 质谱

电离方式：电子轰击（EI）电离模式；电离能量：70 eV；灯丝电流：100 μA；离子源温度：250 ℃；传输线温度：250 ℃；Q2 碰撞气：氮气，纯度（体积分数）为99.999%；溶剂延迟：7 min；扫描方式：动态多反应检测（dMRM）模式。Masshunter 10.0 工作站软件用于仪器控制和数据处理。35 种农药的保留时间及质谱参数见表2。

表2 35 种农药的保留时间及质谱参数

2 结果与讨论

2.1 共萃取基质与色谱峰干扰

基于QuEChERS 原则的处理方法所用的净化材料为无水硫酸镁、N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）和石墨化碳黑（GCB）。无水硫酸镁主要是去除多余水分，增强PSA 的净化效果，排除水分对气相色谱柱的影响；PSA 能有效去除样品溶液中酸性和极性化合物，如有机酸、脂肪酸、部分色素及糖类；C18能除去非极性化合物，如挥发油、萜类、木质素、脂类、类胡萝卜素等；GCB 可以去除大部分色素和甾醇。HLB 法主要是去除样品中挥发油、萜类、磷脂等，对色素去除能力较差。而GCB-NH2法中起净化作用的主要是NH2—和石墨化碳黑，NH2—与PSA 净化原理类似，主要去除样品溶液中极性杂质，如有机酸，脂肪酸等。3 种处理方法净化后的萃取液中共萃取基质的质量如图1所示。由图1 可以看出，基于QuEChERS 原则的处理方法得到的共萃取基质含量最高，为0.031 g，这是因为此方法提取时加入了1%乙酸，水溶性提取物比较多。GCB-NH2法得到的共萃取基质含量最低，为0.014 g，而净化效果比HLB 法好。

图1 3 种处理方法净化后的萃取液中共萃取基质的质量

o，p′-三氯杀螨醇经3 种处理方法得到的提取离子色谱图如图2 所示。由图2 可以看出，基于QuEChERS 原则的处理方法对目标物色谱峰的干扰最严重，HLB 法其次，而GCB-NH2法干扰最小。

图2 o，p′-三氯杀螨醇经3 种处理方法得到的提取离子色谱图

2.2 加标回收与精密度试验

称取金银花空白基质样品3.00 g，加入35 种农药混合标准储备液25 μL，按1.2.1 方法平行处理6 份样品溶液；称取2 份金银花空白基质样品，各5.00 g，分别加入35 种农药混合标准储备液15 μL，分别按1.2.2 和1.2.3 方法各平行处理6 份样品溶液，在1.5 仪器工作条件下分别进行测定，结果见表3。由表3 可知，基于QuEChERS 原则的处理方法回收率最好，除杀虫脒外其它34 种农药回收率均在72.9%～110.9%范围内；GCB-NH2法其次，除两种内吸磷外，其它33 种农药回收率均在68.4%～101.8%范围内；HLB 法回收率稍差，有31 种农药回收率在67.4%～112.5%范围内，回收率较差的主要是3 种滴滴涕农药和杀虫脒，其中4，4′-滴滴伊回收率为53.6%，2，4′-滴滴涕回收率为55.2%，4，4′-滴滴涕回收率为57.2%，杀虫脒回收率为56.1%。

表3 3 种处理条件下35 种农药加标回收与精密度试验结果（n=6）

2.3 3 种处理方法综合对比

基于QuEChERS 原则的处理方法是近几年比较热门的一种样品处理方法［16-17］，此方法不需要对溶剂进行大量浓缩，无需购买固相萃取装置，对于没有条件购置大量自动化处理设备的实验室比较适合，但是此方法主要为手动操作、过程繁琐，净化不彻底，易导致目标物出峰不理想，杀虫脒易被净化材料PSA 吸附造成其回收率偏低，另外也会加快仪器污染和维护频率，增加仪器维护成本。此方法一个样品只能制备2 mL 净化液，若要配制基质标准曲线溶液，需要同时处理3 个空白样品，费时费工。

HLB 法不需要活化和洗脱，固相萃取操作相对简便、快速，亲水亲油材料由于去除挥发油类物质效果较好，适合含挥发油较高的中药材，因此对于一般的药材均可以用此法处理。不足之处在于此方法较其它两种方法回收率稍差，对于一些含有较强极性物质的中药材，如延胡索、丹参处理效果较差，使多种化合物灵敏度降低，甚至在标准工作曲线线性范围内不出峰。

GCB-NH2法的优点在于去除色素效果较好，回收率也比HLB 法稍佳，不足之处在于操作较复杂，固相萃取过程中需要活化和洗脱，固相萃取完以后需要进一步浓缩，耗时较长，而且用到甲苯等毒性较强的有机试剂。对一些挥发油含量特别高的中药材，如广藿香、厚朴、木香等处理效果不佳，部分化合物在标准工作曲线线性范围内不出峰，衬管和色谱柱也会由于样品中挥发油的存在受到污染，从而增加仪器维护成本。

以上3 种处理方法各有优缺点，而中药材种类繁多，每种中药材成分理化性能差异较大，很难建立一种统一的样品处理方法。笔者通过对200 种中药材的处理方法进行摸索，建立了不同中药材样品处理方法数据库，见表4。由表4 可知，大部分中药材用3 种处理方法均可以得到满足要求的检测结果，但是部分中药材只能选择其中一种或两种方法进行处理。含挥发油多的样品，如广藿香，用HLB 法可以得到比较理想的结果，但是采用GCB-NH2法会导致大部分化合物在标准工作曲线线性范围内不出峰。含极性物质较多的中药材，如延胡索和丹参，只能用石墨化碳黑氨基复合柱法进行处理，否则多种农药在标准工作曲线线性范围内不出峰，具体原因有待进一步研究。含挥发油和有机酸较多的中药材，如厚朴、木香、沉香、没药、司卡摩尼亚脂、花椒等，优先选择用HLB 与GCB-NH2相结合的方法，若单用石墨化碳黑氨基复合柱法会导致氟虫腈类物质、六六六、甲基对硫磷、对硫磷、三氯杀螨醇、甲基异柳磷和甲基硫环磷等物质在标准工作曲线线性范围内出峰不理想。另外，值得关注的是大部分基质中农药化合物保留时间均比较稳定，只有某几种基质中的氟虫腈类物质会出现保留时间后移的现象，如厚朴、木香和细辛等基质中的氟虫腈类物质，具体原因有待进一步研究。

表4 200 种药材前处理方法推荐

3 结语

基于QuEChERS 原则的处理方法回收率最好，但是过程操作较繁琐，基质干扰较大；亲水亲油平衡材料（HLB）固相萃取法操作相对较简便，对挥发油类含量较多的中药材处理效果较理想，但是回收率稍差；石墨化碳黑氨基复合柱法除色素能力最强，基质净化效果最佳，但是对挥发油类物质不理想，且过程操作较复杂。由于中药材品种繁多，每种中药材成分理化性能差异较大，不能笼统地建立一种适合所有中药材农药检测的处理方法，因此应根据所检测的中药材的理化特性选择合适的处理方法。