基于QuEChERS 净化提取的液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中氟苯尼考、金刚烷胺和金刚乙胺

倪炜华，陈妍，王丽丽，薛羽晴

(1.嘉兴市食品药品与产品质量检验检测院，浙江嘉兴 314000； 2.北方民族大学生物科学与工程学院，银川 750030)

动物性食品中的兽药或非法添加药物残留对人体健康有着不容小觑的影响。鸡蛋作为优质的高蛋白动物源食品，因其价格、营养、口感等多方面的因素，成为人们不可或缺的食物，因此鸡蛋中兽药或非法添加药物残留问题引起人们高度关注。氟苯尼考为氯霉素的第三代改良版药物。氯霉素是公众熟知的一种抗生素，但它可以导致人体再生障碍性贫血［1］，2002 年3 月15 日，我国农业部发布《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》，将氯霉素列为禁止使用的抗生素。而后，在氯霉素的基础上，研发了甲砜霉素，其毒性相对氯霉素减弱，药效增强。而氟苯尼考是在甲砜霉素的基础上，保留了甲砜基，以氟取代α-甲基位的羟基产生的衍生物，其药效更强［2］。随着进一步研究发现，氟苯尼考具有胚胎毒性，大量、不规范使用易在畜禽、水产等动物性食品中残留，直接影响消费者的健康，并导致耐药菌的产生［3］。GB 31650—2019 《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定，鸡蛋中不允许检出氟苯尼考残留。金刚烷胺和金刚乙胺均属于金刚烷类，是广谱类抗病毒药物，可用于动物的疾病预防和治疗［4］，但此类药物残留通过食物链进入人体后，可在人体积累富集，对人的神经系统造成危害。农业部农医发【2005】33 号文《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》中规定，禁止将金刚烷胺、金刚乙胺用于防治由高致病性禽流感等一类病原微生物引起的病毒性疫病。虽然国家已明确禁止金刚烷类药物的使用，但部分养殖场滥用金刚烷类药物的情况仍然时有发生，例如在2012 年的“速成鸡”事件中，就检测到鸡肉中存在金刚烷胺残留［5］。

目前测定氟苯尼考、金刚烷胺和金刚乙胺的方法主要有免疫分析法［6-7］、气相色谱法［8-9］、气相色谱-串联质谱法［10-11］、液相色谱法［12-13］以及液相色谱-串联质谱法［14-16］等。液相色谱-串联质谱法因具有高分离能力、高选择性和高灵敏度等优势，广泛应用于药物、食品、环境分析等领域。王亚会等［17］利用高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中的金刚烷胺；李诗言等［18］利用高效液相色谱-串联质谱法快速测定乌鳢肌肉中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚残留；李雅宁等［19］建立了超高效液相色谱-串联质谱法检测禽蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留物的方法。目前采用高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡蛋中的氟苯尼考、金刚烷胺和金刚乙胺3 种药物还未见报道。笔者选择QuEChERS 试剂盒对样品进行净化提取，通过优化仪器条件，建立了同时测定鸡蛋中氟苯尼考、金刚烷胺和金刚乙胺残留的液相色谱-质谱串联方法，该方法快速、灵敏，可为保障食品安全提供有效的监控手段。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱质谱联用仪：Agilent 1290 Infinity-6460 型，美国安捷伦科技有限公司。

氮气发生器：CLAIND NIGEN LCMS40-1 型，楷来(上海)科技有限公司。氮吹仪：N-EVAP 型，美国orgnomation 公司。电子天平：JJ600 型，感量为0.01g，常熟双杰测试仪器厂。

电子天平：BS210S 型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯公司。

离心机：TCL-10B 型，上海安亭科学仪器厂。恒温水浴振荡器：SH-B 型，上海精密仪器仪表有限公司。

超纯水仪：PURELAB Chorus 1 型，英国埃尔格公司。

乙腈、甲醇：均为色谱纯，德国默克公司。

甲酸：色谱纯，美国ACS 恩科化学公司。

氟苯尼考标准品：纯度（质量分数）为99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

金刚烷胺、金刚乙胺标准品：纯度（质量分数）均大于99.0%，北京曼哈格生物科技有限公司。

金刚烷胺-D6、美金刚-D6标准品：纯度（质量分数）均大于98.0%，加拿大DRC 公司。

QuEChERS 试剂盒：CQS-2 型，山东青云实验耗材有限公司。

鸡蛋样品：市售。

1.2 溶液配制

氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺、金刚烷胺-D6、美金刚-D6单标储备溶液：100 μg/mL，分别称取氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺、金刚烷胺-D6、美金刚-D6标准品各10.0 mg(精确至0.1 mg)，置于5 只100 mL 容量瓶中，分别加入甲醇溶解并定容至标线，混匀，于-20 ℃下避光保存。

金刚烷胺-D6、美金刚-D6混合内标溶液：质量浓度均为1.0 μg/mL，分别移取金刚烷胺-D6、美金刚-D6单标储备溶液各1.0 mL，置于同一只100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至标线，混匀，于4 ℃下避光保存。

氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺混合标准储备溶液：质量浓度均为1.0 μg/mL，分别移取氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺单标储备溶液各1.0 mL，置于同一只100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至标线，混匀。

氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺系列混合标准工作液：用甲醇溶液逐级稀释氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺混合标准储备溶液，并加入一定量的金刚烷胺-D6、美金刚-D6混合内标溶液，配制成氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺的质量浓度均分别为0.5、2、5、10、20 ng/mL 的系列混合标准工作溶液，其中内标金刚烷胺-D6、美金刚-D6的质量浓度均为5 ng/mL。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent EC-C18柱(100 mm×3.0 mm，2.7 μm，美国安捷伦科技有限公司)；流动相：A 相为0.2%甲酸水溶液，B 相为甲醇；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0～2 min 时B 相体积分数为20%，2～3 min 时B 相体积分数由20%等度过渡到80%，3～6 min 时B 相体积分数为80%，6.01 min 时B 相体积分数直接切换为20%，6.01～8 min 时B 相体积分数为20%；流量：0.3 mL/min；进样体积：5 μL。

1.3.2 质谱条件

电离模式：电喷雾(ESI)正负离子切换模式；监测方式：多级反应监测(MRM)模式；毛细管电压：4.0 kV；雾化气：氮气，纯度（体积分数）为99.9%，温度为350 ℃，流量为11 L/min。氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺质谱参数见表1。

表1 氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺质谱参数

1.4 样品处理

称取5.00 g（精确至0.01 g）试样于50 mL QuEChERS 萃取管中，加入20 μL 质量浓度为1.0 μg/mL 的金刚烷胺-D6、美金刚-D6混合内标溶液，加入20 mL 含1%甲酸的乙腈-水(体积比为80∶20)溶液，涡旋振荡3 min，以8 000 r/min 转速离心8 min，取5 mL 上清液于QuEChERS 净化管中，旋涡混匀1 min，以8 000 r/min 转速离心5 min，上清液全部转移至试管中，于40 ℃水浴中氮吹至近干，用1 mL 甲醇溶解，过0.22 μm 滤膜，待测。

2 结果与讨论

2.1 提取剂选择

分别用0.5%三氯乙酸-乙腈(体积比为1∶1)溶液、1%甲酸-甲醇(体积比为1∶1)溶液［20］和含1%甲酸的乙腈-水(体积比为80∶20)溶液作为提取剂，考察不同提取溶剂对3 种待测化合物的提取效果。结果发现，3 种提取剂的提取效率基本一致，以0.5%三氯乙酸-乙腈溶液作为提取剂时，提取液离心后易出现絮状沉淀；以1%甲酸-甲醇溶液作为提取剂时，出现杂峰且色谱峰形拖尾；以含1%甲酸的乙腈-水溶液作为提取剂时，离心后提取液澄清，目标物色谱峰形尖锐且无杂峰，提取效率高，故选择含1%甲酸的乙腈-水(体积比为80∶20)溶液作为提取剂。

2.2 流动相选择

氯霉素类化合物常用的流动相为甲醇-水、乙腈-10 mmol/L 乙酸铵水溶液等，金刚烷类常用甲醇-乙酸水溶液或甲醇-甲酸水溶液［21］作为流动相。本试验选择甲醇-甲酸水溶液作为流动相。考虑到金刚烷胺、金刚乙胺在正离子模式下具有良好的电离效果，而氟苯尼考在负离子模式下有良好的电离效果，而流动相中加入甲酸有利于正离子模式下化合物的电离，对负离子模式下化合物的电离稍有抑制作用。通过对比不同体积分数甲酸水溶液作为流动相时的试验结果，发现用甲醇-0.2%甲酸水溶液作为流动相对被测物进行梯度洗脱，氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺均能得到响应较高的离子碎片，且色谱峰形良好，满足检测要求。鸡蛋空白样品和加标样品总离子流图如图1 和图2 所示，氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺的多反应监测色谱图如图3～图5 所示。

图1 空白样品总离子流图

图2 加标样品总离子流图

图3 氟苯尼考MRM 色谱图

图5 金刚乙胺MRM 色谱图

2.3 质谱条件优化

图4 金刚烷胺MRM 色谱图

根据氟苯尼考、金刚烷胺和金刚乙胺的结构特点，金刚烷胺、金刚乙胺选择ESI+电离模式，生成较强的［M+H］+准分子离子，氟苯尼考选择ESI-电离模式，生成较强的［M-H］-准分子离子，适合进行多级质谱分析。将氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺混合标准储备溶液以流动注射方式在正离子模式下进行金刚烷胺、金刚乙胺母离子全扫描，在一级全扫描质谱中得到准分子离子［M+H］+，调节相应参数，使［M+H］+峰的丰度最大；然后对［M+H］+进行二级质谱分析，选择最佳子离子，同时优化碰撞电压，最后确定定量、定性离子对。氟苯尼考相关参数在负离子模式下得到。优化结果见表1。

2.4 线性方程与检出限

在1.3仪器工作条件下，分别对1.2中氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺系列混合标准工作液进行测定，以质量浓度为横坐标（x）、以色谱峰面积（氟苯尼考）或色谱峰面积与内标色谱峰面积比值（金刚烷胺和金刚乙胺）为纵坐标（y）绘制标准工作曲线，计算线性回归方程及相关系数。以3 倍信噪比对应的待测化合物的质量浓度作为方法检出限，根据样品质量、提取体积、稀释倍数和定容体积换算为样品中的质量分数。氟苯尼考、金刚烷胺和金刚乙胺质量浓度线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表2。由表2 可知，3 种化合物的质量浓度在0.5～20 ng/mL范围内均具有良好的线性关系，相关系数均不小于0.998，方法检出限为1.0 μg/kg，满足分析要求。

表2 线性范围、线性方程、相关系数及检出限

2.5 加标回收与精密度试验

准确称取5.0 g 鸡蛋空白基质，分别加入氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺混合标准储备溶液5、25、50 μL（氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺的质量分数分别为1.0、5.0、10.0 μg/kg），然后加入金刚烷胺-D6、美金刚-D6混合内标溶液20 μL，按1.4 样品处理方法，每种加标浓度水平平行处理6 份样品溶液，在1.3 仪器工作条件下分别进行测定，计算平均回收率和测定结果的相对标准偏差，结果见表3。根据NY/T 1896—2010 《兽药残留实验室质量控制规范》和GB/T 27404—2008 《实验室质量控制规范食品理化检测》规定，平均回收率应在60%～120%的范围内，测定结果的相对标准偏差应小于30%。由表3 可知，该方法平均回收率为84.0%～117.9%，测定结果的相对标准偏差为5.6%～12.0%，符合标准要求。

表3 加标回收与精密度试验结果

3 结语

建立了基于QuEChERS 净化提取的液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中氟苯尼考、金刚烷胺和金刚乙胺的方法。该方法便捷，高效，准确度和精确度较好，满足鸡蛋中氟苯尼考、金刚烷胺和金刚乙胺同时测定要求。