miRNA-125b、miRNA-34a在不同分型鼻息肉中的表达与相关性分析

颜抗 聂琛 胡环宇 马亚琳

鼻息肉(nasalpolyps)是发生于鼻腔和鼻窦黏膜的慢性疾病，以极度水肿的鼻黏膜在中鼻道形成单发或多发息肉为临床特征，发病率与复发率均极高，是一种鼻科常见病[1]。鼻息肉的临床表现因息肉出现的位置、大小及多少而异[2]；通常来说，体积较小的息肉可无明显症状，较大的息肉可出现鼻塞、嗅觉减退等表现[3]；常发生于支气管哮喘、阿司匹林耐受不良、变应性真菌性鼻窦炎与囊性纤维化患者[4]。目前鼻息肉最有效的治疗方法为鼻内镜手术加糖皮质激素治疗[5]，但是治疗后仍有20%左右复发，是鼻科目前治疗的难点[6]。鼻息肉的发病可能与变态反应、阿司匹林耐受不良、遗传、鼻腔纤毛功能障碍、中鼻道微环境等有关[7]。本研究通过研究miRNA-125b和miRNA-34a在正常鼻黏膜、鼻息肉、复发性鼻息肉中的表达情况，期望能找到miRNA-125b和miRNA-34a对鼻息肉发生、发展、复发的影响及规律。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年3月至2021年3月于我院就诊的行鼻内镜下手术患者71例,分为正常对照20例，初发鼻息肉患者27例，复发鼻息肉患者24例。初发患者包括单发鼻息肉21例，多发鼻息肉6例，男女比例为16∶11；年龄27～59岁，平均年龄(39.3±15.9)岁；复发患者包括单发鼻息肉15例，多发鼻息肉9例，男女比例为13∶11，年龄31～57岁，平均年龄(41.7±16.2)岁。收集手术切除患者的增生息肉组织，对照组收集正常鼻黏膜组织作为试验材料，共收集标本71份，收集后立即置于经DEPC处理的EP管中，放置于-80℃冰箱，保存备用。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器：高速冷冻离心机(3K30，德国Sigma公司)；超低温冰箱(DW-86L288，海尔公司)；血细胞分析仪(RS300，江苏鸿恩医用设备有限公司)；电泳仪(BL61-DYCZ-24A，北京中西远大公司)；微量核酸分析仪(Nano 400A，杭州艾普仪器设备有限公司)；荧光定量PCR仪(7500，ABI公司)。

1.2.2 试剂：miRNA-125b、miRNA-34a特异性引物(eBioscience公司，美国)；逆转录试剂盒、定量PCR试剂盒(北京中杉公司)；Trizol试剂、RNase free water(上海生工)；氯仿、异丙醇、乙醇均由国药集团化学试剂有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 EOS水平检测：术前1 d抽取空腹静脉血，置于抗凝管内，使用全血细胞自动分析仪进行血细胞比例分析，当EOS比例>5.0%时记录为阳性(+)。

1.3.2 荧光定量PCR检测miRN-125b和miRN-34a的表达在鼻黏膜组织及息肉组织中的表达：将冻存完好的样本组织置于室温自然解冻，取约100 mg置于经RNase free EP管中，加入Trtzol Reagent，匀浆，震荡，提取样本总RNA，离心(12 000 r/min，10 min，4℃)；取上清液，加氯仿适量，剧烈震荡约30 s，使混匀，室温避光放置10 min以上，离心(12 000 r/min，10 min，4℃)；取上清液，转移至另一新的RNase free EP管中；加入等体积异丙醇，缓慢摇匀，-20℃，放置24 h，离心(12 000 r/min，10 min，4℃)，收集沉淀；加入少量75%乙醇溶液，轻轻颠倒EP管，离心(12 000 r/min，5 min，4℃)，重复2次；置于超净台中风干，加入0.2 ml RNase free water溶解备用。将上述提取的RNA进行逆转录、灭活、PCR扩增、电泳、凝胶成像分析(PCR反应条件为：PCR Buffer 5 μl，dNTP 1 μl，EsTaq Master-Mix 100 μl，RT反应产物10 μl，上下游特异性引物各25 mmoL，总体积50 μl；PCR循环参数为：94℃，3 min；58℃，30 s；72℃，1 min，循环35次，最后1个循环72℃延长至7 min)。

2 结果

2.1 EOS表达水平 不同类型鼻息肉组织与正常鼻黏膜组织中EOS阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)；全部鼻息肉组织标本(包括初发型鼻息肉、复发型鼻息肉患者的标本组织，n=51)的EOS阳性率为76.47%(39/51)。见表1。

表1 EOS表达水平

2.2 miRNA-125b和miRNA-34a表达水平 不同病理类型的标本组织中miRNA-125b、miRNA-34a表达水平不同，正常标本组织中miRNA-125b和miRNA-34a表达水平均较低，而初发组与复发组中，miRNA-125b和miRNA-34a的平均表达水平升高，2组标本组织中miRNA-125b平均表达水平约为正常标本组织的4倍，miRNA-34a的平均表达水平分别接近正常标本组织的1.5和2倍。各组间miRNA-125b表达水平存在显著差异(P<0.05)；miRNA-34a的表达水平差异显著(P<0.05)。见表2。

表2 miRNA-125b、miRNA-34a表达水平

2.3 EOS与miRNA-125b、miRNA-34a相关性分析 列联系数法分析得出，EOS与miRNA-125b、miRNA-34a表达明显呈相关性(P<0.05)。EOS与miRNA-125b的相关系数为0.375(P=0.032)，与miRNA-34a的相关系数为0.283(P=0.045)。见表3。

表3 嗜酸性粒细胞与miRNA-125b、miRNA-34a表达的相关性

3 讨论

有研究认为鼻息肉是染色体隐性遗传性疾病，也有认为其属于多基因遗传[8]。人类白细胞抗原(HLA)

是迄今为止发现的人类最具有多态性的基因复合体，有研究发现特定HLA等位基因与鼻息肉之间有一定的相关性[9,10]。现有研究表明参与鼻息肉病理过程十分复杂，过敏因素及成纤维细胞在其中扮演重要角色[11,12]；既往研究表明，miRNA-125b和miRNA-34a在调控嗜酸性粒细胞和成纤维细胞中起关键作用[13,14]，多种炎性因子的表达和E0S的作用是鼻息肉发生的重要环节[15]。鼻黏膜的慢性炎症同时停随着局部组织的重构，病理上主要表现为上皮细胞化生，基底膜增厚，胶原及细胞外基质(ECM)沉积，间质纤维化，血管形成等，其具体机制仍有待阐明[16,17]。

本研究通过观察miRNA-125b和miRNA-34a其在不同鼻息肉组织中的表达情况，结合临床表现和血中EOS计数，分析其在不同类型鼻息肉患者的表达，特别是复发性鼻息肉的病因提供新的靶点，找到和嗜酸粒细胞活化和MAK信号通路的调控关系。通过选取初发鼻息肉及复发鼻息肉患者51例，正常对照20例，发现正常组织、初发鼻息肉组织、复发鼻息肉组织中EOS的阳性率不同类型鼻息肉组织与正常鼻黏膜组织中EOS阳性率比较差异有统计学意义，正常组EOS水平极低，初发组与复发组远高于正常组，但是复发组又高于初发组约13%，EOS水平与鼻息肉是否发生存在相关性，但是与复发几率的关系尚不清晰。初发组、复发组标本组织中miRNA-125b平均水平约为正常标本组织的4倍，miRNA-34a的平均表达水平分别接近正常标本组织2倍，各组间miRNA-125b水平存在显著差异，miRNA-34a的水平也存在显著差异；EOS与miRNA-125b的相关系数为0.375，与miRNA-34a的相关系数为0.283；说明鼻息肉的发病受到miRNA-125b、miRNA-34a水平的调控，而且鼻息肉是否复发也与此2种miRNA紧密相关。

既往研究说明miRNA-125b、miRNA-34a水平在鼻息肉的发生和发展中起作用，目前鼻息肉的治疗主要是局部激素和手术治疗，但没有很好的方法区分鼻息肉的性质，也没有找到复发性鼻息肉的真正原因和指导下一阶段治疗的指标[18,19]。与蛋白质相比，miRNA是一种在体内存在相对较稳定的形式，有可能成为潜在的一个非侵入性的生物学标志[20]。癌症的临床前期研究显示，miRNA有很大可能成为疾病诊断及预后判断的一个生物标志物。

综上所述，miRNA-125b、miRNA-34a水平与EOS水平及鼻息肉的发病存在密切相关性，此相关性对鼻息肉靶向治疗及预后具有重要意义。