青龙衣化学成分体内抗肿瘤作用及其急性毒性试验研究

周媛媛，刘宁雨，马丹娜，高蕙蕊，张晓娟，刘雨新，方振兴

(1.黑龙江中医药大学 教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；2.日本岛根大学医学部，日本 岛根县 6938501；3.黑龙江省科学院自然与生态研究所，黑龙江 哈尔滨 150040)

青龙衣为胡桃科植物胡桃楸(JuglansMandshuricaMaxim)的果实青皮，又名胡桃青皮，青龙衣一名始见于《山东中草药手册》[1-3]。《中药大辞典》记载其味辛、苦，性涩、平，以清热解毒、祛风疗癣、止痛止痢等功效入药[4-5]。据文献报道，青龙衣的主要化学成分包括萘醌类、黄酮类、二芳基庚烷类、三萜类、有机酸类及多糖类等，其中部分类型化合物稳定性差、具有挥发性或易氧化的特点[6-7]，如一些小分子萘醌苷元、鞣质类成分等。青龙衣的抗肿瘤活性强，且治疗范围广，目前临床上已用于治疗胃癌、肺癌、食管癌等疾病[8-9]。李彩霞等[10]研究表明，核桃青皮粗提物可以引发KYSE150人食管癌细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期，并且可以通过线粒体途径诱导KYSE150细胞凋亡。高启龙等[11]研究证明，青龙衣含药血清通过诱导凋亡与抑制Wnt/β-catenin通路的活化对人胃癌细胞 SGC-7901细胞产生抑制作用。王爽等[12]发现青龙衣提取物能明显抑制Lewis肺癌细胞的增殖，抑制率为85.4%(P<0.05)。为了进一步研究青龙衣中抗肿瘤药效物质基础，本实验对青龙衣中分离出的6个单体化合物进行了细胞毒性、急性毒性相关研究，也为进一步开展抗肿瘤机制研究提供参考。

1 材料

1.1 药材

本实验所用青龙衣药材于2018年采集自吉林长白山山脉，经黑龙江中医药大学中药资源教研室王振月教授鉴定为胡桃科胡桃属植物胡桃楸(JuglansMandshuricaMaxim)的未成熟外果皮，目前样品保存于黑龙江中医药大学药学院中药化学实验室。

1.2 细胞株

人胃癌BGC-823细胞、肠癌HCT-15细胞由哈尔滨医科大学肿瘤研究所提供。

1.3 动物

昆明小鼠180只，雌雄各半，体质量18～22 g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(辽)2020-0001，自由饮水，定时通风，湿度保持40%～60%，平衡饲养1周后进入正式实验。

1.4 实验仪器与试剂

CO2培养箱(美国Thermo公司)；多功能酶标仪(美国Bio-Rad公司)；倒置显微镜(日本Tokyo公司)；超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)；超低温冰箱(美国 Thermo公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国HyClone公司)；青霉素-链霉素双抗(美国Thermo公司)；二甲基亚砜(DMSO，天津市富宇精细化工有限公司)；96孔培养板(美国Corning公司)；噻唑蓝(MTT，大连美仑生物技术有限公司)。

2 方法

2.1 细胞毒实验

取96孔培养板，四周培养孔设置为空白组，加入PBS 200 μL/孔，剩下的孔进行正常接种，取生长状态良好的肿瘤细胞，用0.25%胰蛋白酶消化使其脱壁，再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释细胞，使其浓度范围在(4×104)～(7×104)个/mL，按100 μL/孔加入孔板内，每一个筛选条件均设置3个复孔，并设置不加细胞的完全培养基孔为空白对照，向每孔分别加入浓度为8、6、4、2、1 mg/L的待测样品溶液20 μL。于37 ℃ 5% CO2条件下常规培养4 h后，每孔加入MTT液20 μL(5 mg/mL)，弃去培养液，每孔加入120 μL DMSO，然后进行显微镜观察细胞形态，酶标仪570 nm处测定OD值。以配置各化合物的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制浓度效应曲线，计算IC50值。

2.2 急性毒性试验

按寇氏法每组10只小鼠，以正常小鼠为空白对照，胡桃醌、3-乙氧基胡桃醌、12β,20(R),24(R)-三羟基达玛烷-25-烯-3-酮、20(S)-原人参二醇、2α,3β,23-三羟基-12-烯-28-熊果酸、Juglanin A药物溶液以0.2 mL/10 g体质量腹腔注射，各组药物浓度根据小鼠平均体质量(20 g)水平计算，腹腔注射后观察动物行为、摄食、分泌物、排泄物以及中毒死亡情况，连续观察2周。

3 结果

3.1 对BGC-823 细胞、HCT-15细胞形态的影响

在光学显微镜下空白组的BGC-823和 HCT-15细胞数量明显增多，胞质丰富、胞核较大，相邻细胞生长融合成片，贴壁牢固，折光性好。分别给予化合物胡桃醌、3-乙氧基胡桃醌、12β,20(R),24(R)-三羟基达玛烷-25-烯-3-酮、20(S)-原人参二醇、2α,3β,23-三羟基-12-烯-28-熊果酸、Juglanin A处理后的BGC-823细胞均出现不同程度的凋亡现象，细胞相对较小，胞浆减少，核固缩，部分细胞碎裂，具体情况如图1所示。

注:A.对照组;B.胡桃醌组;C.3-乙氧基胡桃醌组;D.12β,20(R),24(R)-三羟基达玛烷-25-烯-3-酮组;E.20(S)-原人参二醇组;F.2α,3β,23-三羟基-12-烯-28-熊果酸;G.Juglanin A组。图1 显微镜下观察空白组及各药物组的BGC-823、HCT-15细胞形态(×200)

3.2 对各瘤株细胞IC50值测定

胡桃醌、3-乙氧基胡桃醌、12β,20(R),24(R)-三羟基达玛烷-25-烯-3-酮、20(S)-原人参二醇、2α,3β,23-三羟基-12-烯-28-熊果酸以及Juglanin A对BGC-823细胞和HCT-15细胞均有细胞毒作用，且敏感度具有差异性。且针对BGC-823细胞和HCT-15细胞均以胡桃醌的IC50值最小分别为(9.6±2.35)μmo1/L和(27.8±2.66)μmo1/L，说明胡桃醌对人胃癌BGC-823和人肠癌HCT-15细胞的抗体外增殖作用均表现最强，抑制率情况见表1。

表1 6个单体化合物对BGC-823和HCT-15的IC50值比较

3.3 急性毒性试验结果

最高剂量组给药6 h后发现胡桃醌组小鼠出现不安，呼吸急促，随后0.5 h内死亡。其他给药组高剂量组仅见运动迟缓，精神萎靡，嗜睡不食等现象。通过观察死亡情况，计算小鼠LD50值情况及置信区间见表2。

表2 6个单体活性成分LD50(n=10，mg/kg)

4 讨论

实验对青龙衣的6种化学成分胡桃醌、3-乙氧基胡桃醌、12β,20(R),24(R)-三羟基达玛烷-25-烯-3-酮、20(S)-原人参二醇、2α,3β,23-三羟基-12-烯-28-熊果酸、Juglanin A分别进行了细胞毒活性和急性毒性试验。细胞毒实验结果表明，6种化合物均有细胞毒作用，其中胡桃醌细胞毒作用最强，IC50值为(9.6±2.35)μmo1/L和(27.8±2.66)μmo1/L。而急性毒性试验结果表明，6种化合物均有急性毒性作用，其中胡桃醌毒性作用最强，LD50值为33.57 mg/kg，95%置信区间为29.53～38.16 mg/kg。本研究进行了青龙衣的急性毒性试验研究，从而为初步判断青龙衣的毒性大小及可能存在的危害提供了实验基础，为后续的长期毒性试验以及药效学实验提供了剂量参考，而且也可以通过实验中小鼠的急性毒性反应症状，来推测青龙衣在小鼠体内的药动学变化，为青龙衣的药动学研究奠定实验基础。

研究结果表明，这些化合物均为青龙衣中抗肿瘤活性成分，其中胡桃醌表现出良好的体外抗肿瘤活性，但是胡桃醌同样具有明显的毒性作用，提示虽然胡桃醌在开发抗肿瘤新药方面有较大研究价值，但需要进行适当结构修饰改造或寻找其他“高效低毒”化学成分进行替代，本实验中三萜类成分如20(S)-原人参二醇既具有较好的细胞毒活性又兼具低毒性特点，具有良好的抗肿瘤研究前景。