磁性微纳材料在真菌毒素分析检测中的应用研究进展

陈晴晴，王晓英

（东南大学 公共卫生学院 环境医学工程教育部重点实验室，江苏 南京 210009）

真菌毒素是真菌在食品或饲料中生长所产生的代谢产物。目前已知的真菌毒素种类达400余种，主要由3类真菌产生，即曲霉菌属、镰刀菌属和青霉菌属。其中，黄曲霉毒素（AFs）（以黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）为代表）［1］、赭曲霉毒素（OTs）（以赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）为代表）、伏马菌素（FBs）（以伏马菌素B1（Fumonisins B1，FB1）为代表）［2］、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）［3］、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（（Deoxynivalenol，DON）［4］几类毒素具有强毒性和高污染频率，极易通过食物链各个环节在动物和人体内蓄积，进而产生一系列健康危害，是目前集中研究的主要真菌毒素［5］。根据世界粮农组织报告，全球大约有25%的粮食受到真菌毒素污染［6］。然而，真菌毒素污染率调查受各地区对真菌毒素的重视度、使用的分析方法和监管水平等因素影响，其真实污染率可能高达60%～80%［7］。人类暴露于真菌毒素的风险不容忽视，防控真菌毒素污染势在必行，而真菌毒素的检测是其污染防控的关键环节。国际标准化组织（ISO）、欧洲标准委员会（CEN）、美国分析化学家学会（AOAC）和我国均在食品真菌毒素检测方面开展了大量工作，陆续出台了多项检测标准。如GB 2761-2017［8］对不同食品中的各种真菌毒素做出了限定，其中AFB1限量标准最低，在0.5～20μg/kg之间；OTA限量标准为2～10μg/kg；而ZEN和DON只涉及谷物及其制品的限量标准，分别为60μg/kg和1 000μg/kg。食品中的真菌毒素检测不仅需要灵敏度高的检测方法，也亟需消除复杂食品基质带来的干扰。目前，最常用的方法是高效液相色谱法（HPLC）和色谱联用法，其灵敏度高，稳定性好，适用于多组分分析［9］；但分析时间较长，需进行复杂的前处理消除基质干扰，不利于检测方法的普及。相较上述国标方法，传感方法无需前处理、操作简便，是极具潜力的真菌毒素检测新方法［10］。近年，各种纳米材料、前处理技术与国标方法、传感方法的有机结合，有效提高了分析方法的准确性、灵敏度和响应速度，且有利于消除基质效应，为真菌毒素的分析研究提供了新的思路和手段。

磁性微纳材料（Magnetic micro－nano material，MMNPs）是一类具有独特超顺磁性、表面效应、纳米酶样活性的特殊微纳材料，易于从谷物、粮油、牛奶等复杂食品基质中磁选分离出痕量真菌毒素［11］，与前处理技术结合并偶联国标方法，可简化操作，减少干扰，提高响应速度；同时其亦可作为固定载体、信号标签和修饰界面应用于新型传感方法，放大响应信号，提高检测灵敏度。近年来，MMNPs在全球范围内多种毒素的分析检测中都有应用，亦取得了诸多进展（图1），也有一些围绕MMNPs前处理分析和评价其检测手段的报道，但并没有对MMNPs的理化特性、改性手段、应用方式进行全面概括的研究进展。本文对目前MMNPs在真菌毒素分析检测中的应用方式进行分类，并分类阐述了不同应用方式下国标方法、传感方法的最新研究与应用，分析探讨各类应用方式的优势和劣势，并展望了其最新发展方向。

图1 近十年基于MMNPs的不同代表性真菌毒素检测（A）及其在不同国家地区的应用（B）Fig.1 Detection applications of different representative mycotoxins（A）and different countries and regions（B）based on MMNPs in recent decade

1 MMNPs

MMNPs是至少有一维尺寸在纳米至微米级别的铁、钴、镍基材料，包括Fe3O4、Ni和Co3O4等。其中，Fe3O4磁性强、生物相容性好，是真菌毒素检测等分析领域最常用的磁性载体材料［12］。以Fe3O4为核，表面覆盖高分子复合材料，再经免疫学技术结合相应的抗原或抗体，可制备免疫改性的MMNPs，即免疫磁珠（Immunomagnetic beads，IMB），其尺寸可达微米级别［13］，因此本文中MMNPs为Fe3O4和IMB。

MMNPs具有普通纳米材料的优良表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应；同时又具有独特的超顺磁性［10］和纳米酶样活性［14］。在外磁场作用下，MMNPs被磁化产生磁作用力，发生聚集或移动；撤除磁场后，其内能会超过畴壁能对磁矩的束缚作用，恢复磁“无序”状态。同时，MMNPs能模拟酶的催化中心，催化过氧化物反应，并可与其他过氧化物酶活性物质协同作用。鉴于以上特性，MMNPs具有很强的可操控性，广泛应用于生物分离检测。

MMNPs易团聚，常通过有机物、纳米材料、生物分子/模拟生物分子对MMNPs改性，改善其分散性、稳定性、对生物相容性及比表面积等，并应用于真菌毒素检测中。改性可捕获大量靶标，经磁选实现分离，是理想的固定载体；其亦可与信号分子结合形成复合信号标签，放大信号，提高检测灵敏度；改性MMNPs修饰界面可有效提高检测界面的比表面积、稳定性等，优化检测性能（图2A）。近年，MMNPs通过固定载体、信号标签、修饰界面及混合应用这几种方式广泛应用于真菌毒素分析检测中。其中，传感方法中几种方式均有应用，且以固定载体功能为主；而国标方法中仅发挥固定载体功能（图2B）。

图2 近十年改性MMNPs在代表性真菌毒素检测方法中的3种应用方式（A）及应用比例（B）Fig.2 Three application（A）and its’proportion（B）of modified MMNPs used in the detection of representative mycotoxins in recent decade

2 MMNPs应用——固定载体

MMNPs可通过有机物、纳米材料和生物分子/模拟生物分子改性，改性后的MMNPs比表面积增加，表面活性位点增多，可有效提高捕获靶标数量，并经磁选实现与基质的分离。相较于普通纳米材料，MMNPs因独特的磁性分离功能，简化的离心洗涤过程，有效减少了固定载体与靶标的损失，广泛应用于真菌毒素的国标和传感方法中。

2.1 国际方法

2.1.1酶联免疫吸附法（ELISA）ELISA是将抗原或抗体结合于固相载体，利用抗原-抗体特异性免疫反应进行检测的方法，是真菌毒素快速分析的主要国标方法。Hendrickson等［15］以MMNPs为载体固定ZEN抗体，形成ZEN抗体-抗原免疫复合物，通过鲁米诺化学发光反应检测过氧化物酶活性以检测ZEN，检出限（Limit of detection，LOD）为4 pg/mL。为克服传统ELISA酶标记抗体制备和纯化难的问题，Wu等［16］以纳米酶、适体（Aptamer，Apt）和MMNPs为基础，建立了AFB1的新型ELISA检测方法。以介孔SiO2/Au-Pt（m－SAP）为纳米酶，基于Apt与AFB1的特异性识别，通过MMNPs磁选对AFB1进行测定，方法的LOD为5 pg/mL。MMNPs作为固定载体应用于ELISA，对靶标进行预富集可有效提高检测灵敏度。

2.1.2色谱法高效液相色谱法（HPLC）和色谱联用法是定量分析多种真菌毒素的常用国标方法，需通过准确、高效的样本前处理净化复杂基质，以提高靶标的吸附量与特异性。以MMNPs为新型吸附剂的磁性固相萃取法操作简便，净化效率优于免疫亲和柱等传统前处理方法［17］。MMNPs逐渐从未改性MMNPs发展到有机物改性MMNPs，再到纳米材料改性，最后到生物分子/模拟生物分子改性。改性MMNPs可有效增加靶标的吸附量，显著提高特异性。

未改性MMNPs的表面电荷与多数毒素相同，其间的静电排斥作用会阻碍毒素的吸附，故常与液－液微萃取联用，以有机溶剂萃取毒素，再通过未改性MMNPs吸附有机溶剂［18］。为改变MMNPs表面携带的电荷，可采用有机物为MMNPs提供氨基、羧基和硫醇基等官能团，并通过静电作用吸附毒素，提高选择性［19］。尽管有机物改性MMNPs改善了对靶标的选择性，但其表面活性位点有限。纳米材料比表面积大，可为MMNPs提供大量表面活性位点，且可通过氢键和π－π堆积作用等选择性吸附毒素，如碳基纳米材料和金属有机框架结构（Metal organic framework，MOF）［20］。Yu等［21］合成了还原氧化石墨烯（rGO）结合MMNPs（rGO/MMNPs），对AFs进行吸附后采用HPLC－FLD检测，回收率为80.4%～106%。此外，新型多孔纳米材料MOF具有较高比表面积和可调节孔径，与MMNPs复合，可以提高提取效率［22］。上述未改性MMNPs、有机物和纳米材料改性MMNPs依据毒素的结构和特征基团进行识别，存在特异性不足的问题。

以有机物或纳米材料改性MMNPs为基础，结合抗体、分子印迹聚合物（Molecular imprinted polymer，MIP）或Apt特异性捕获靶标，可快速、准确地将靶标从复杂样品中分离出来。抗体－MMNPs吸附剂已广泛应用于毒素的前处理，如AFB1［23］、OTA［24］、ZEN［25］等。但抗体存在重复利用率低、生物活性不稳定等问题，性能亟待改善。MIPs通过聚合物制备，稳定性好，可重复利用。Huang等［26］以MMNPs为磁芯，改性埃洛石纳米管为支撑材料，选择性MIPs为壳层，制备了磁性分子印迹聚合物（mMIPs）作为分散固相萃取的吸附剂，对玉米样品中的ZEN进行纯化和富集。该方法的LOD为2.5 ng/mL。目前，mMIPs多应用于AFs、OTA、单端孢菌素族毒素等已知功能分子与模板分子的真菌毒素，在其他真菌毒素中的应用仍受限。因此，mMIPs的靶分子少，并未应用于全部真菌毒素。相较于抗体与MIPs，Apt靶分子范围广、特异性强、稳定性高［27］。Zhang等［28］在MIL-101（铁基MOF）表面分散MMNPs形成磁性MOF（MMIL－101），利用生物素-亲合素系统将Apt修饰于MMIL-101表面，捕获OTA后进行UHPLC－MS/MS分析，方法的LOD为0.067 ng/L，回收率为82.8%～108%。改性MMNPs显著提高了真菌毒素分析检测的灵敏度、特异性，且稳定性及可重复性良好，具有潜在的应用前景。

2.2 传感方法

传感方法是通过不同传感策略将靶标浓度转化为光电信号进行检测的方法。根据输出信号类型可分为光传感法和电传感法。

2.2.1光传感法MMNPs可经有机物、纳米材料和生物分子改性构建丰富的荧光传感器（表1）。Zhang等［29］基于GO改性MMNPs，利用荧光共振能量转移（FRET）猝灭四甲基罗丹明戊二胺的荧光，对黄曲霉毒素M1（AFM1）的LOD为3.8 ng/L。Jiang等［30］利用胺基化MMNPs修饰互补DNA，并分别与两种功能性双色持久发光纳米粒子修饰的Apt（PLNPs－Apt）杂交，构建了同时检测AFB1和ZEN的荧光传感器。靶标存在时，PLNPs－Apt被释放到溶液中，上清液的荧光信号增高，该法对AFB1和ZEN的LOD分别为0.29 pg/mL和0.22 pg/mL。

表1 MMNPs作为固定载体在真菌毒素荧光法中的应用Table 1 Application of MMNPs as fixed carrier in mycotoxin fluorescence sensing detection

此外，改性MMNPs还可进一步修饰荧光材料。如以荧光材料上转换纳米晶（UCNs）［31］修饰MMNPs（UCNMMs），再结合模拟抗原，捕获相应抗体。Zhang等［32］以UCNMMs为荧光标记，在其表面包覆AFB1－BSA，并使AFB1和AFB1－BSA通过间接竞争免疫反应结合AFB1抗体，再与藻红蛋白标记的二抗结合，通过藻红蛋白放大UCNMMs信号，得到AFB1的LOD为9 pg/mL。

2.2.2电传感法电传感法中，常以多孔SiO2改性MMNPs增加比表面积，再以抗体或Apt进一步改性MMNPs，提高靶标的固载量和特异性，最后以酶或量子点（QDs）等为电化学标签检测靶标（表2）。常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）［43］和碱性磷酸酶（ALP）［44］。Hao等［45］利用AuNPs功能化MMNPs@SiO2（mSiO2@Au），以Au－S键链接DNA1制备DNA1－mSiO2@Au，利用碲化镉量子点（CdTe－QDs）改性石墨烯/AuNPs纳米复合材料（rGAu/CdTe）修饰DNA2（DNA2－rGAu/CdTe），通过OTA适配体形成DNA1－mSiO2@Au/Apt/DNA2－rGAu/CdTe的检测平台，以方波伏安法（SWV）检测CdTe－QDs的信号，方法对OTA的LOD为0.07 pg/mL。比率法通过内部校准机制降低背景电信号，较上述单信号电化学传感器更准确。Wang等［46］以MMNPs@SiO2固定CdTe－cDNA作为内部参考标记，以SiO2@PbS－QDs修饰Apt作为外部信号标记，形成MMNPs@SiO2/CdTe－cDNA－Apt/PbS@SiO2，当OTA存在时，Apt/PbS@SiO2释放，磁选分离后检测Pb2+和Cd2+的SWV信号，该方法检测OTA的LOD为4.5 pg/mL。

表2 MMNPs作为固定载体在真菌毒素电传感法中的应用Table 2 Application of MMNPs as fixed carrier in mycotoxin electrochemical sensing detection

3 MMNPs应用——信号标签

未改性MMNPs可直接作为信号标签，利用纳米酶样活性催化底物检测真菌毒素，提高检测灵敏度。改性MMNPs可与不同信号分子结合形成光学、电学复合信号标签，放大信号；经磁选分离后还可减少干扰及基质效应。两类信号标签广泛应用于真菌毒素传感检测中。

3.1 光传感法

光传感法中，上述两种类型信号标签均有应用。如Zhu等［52］利用MMNPs与AuNPs协同发挥纳米酶样活性，获得了更强的过氧化氢催化效果。以MMNPs@AuNPs为信号标签，在酸性条件下，催化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）可检测OTA；负载MMNPs（MMNPs/GO）和负载百里酚酞的氧化石墨烯（TP/GO）通过AFB1适配体形成检测平台，当AFB1存在时与相应的Apt结合并导致检测平台解离，TP/GO被释放，碱性条件下，溶液变成蓝色，可以此定量检测AFB1，实现真菌毒素的同时检测。AFB1和OTA的检测范围分别为5～250 ng/mL和0.5～80 ng/mL（图3A）。

Mahdi等［53］将罗丹明123（Rho123）结合到SiO2改性MMNPs上制备光学复合标签，并以此标记OTA抗原，与OTA竞争CdTe－QDs标记的OTA抗体的结合位点，光学复合标签标记的OTA抗原和OTA抗体的免疫结合反应使Rho123（受体）靠近QDs（供体）发生FRET，同时MMNPs@SiO2的核壳结构增强了FRET信号，基于Rho123与QDs之间的FRET对OTA进行检测，其LOD为0.8 pg/mL（图3B）。

3.2 电传感法

电传感法中，仅应用改性MMNPs作为电学复合标签，根据结合的信号分子种类可进一步分为酶型和非酶型。其中，非酶型复合标签稳定性好，可被外部磁场回收，从而可简单再生。最常用的酶型电学复合标签是HRP结合MMNPs形成的HRP－MMNPs复合标签。如Peng等［54］以HRP－AuNPs－SiO2@MMNPs作为信号标签，连接脱氧核糖核酸辅助链（H1），再通过电沉积三维有序大孔二硫化钼-金纳米粒子（3DOM－MoS2－AuNPs）膜修饰电极，将掺入AFB1-Apt的四面体DNA纳米结构（TDNs）结合在3DOM－MoS2－AuNPs上使AFB1－Apt有序排列，Apt与AFB1结合后从电极表面释放，形成无杂交TDNs，信号标签通过H1和无杂交TDNs的结合，固定到电极表面，以硫堇（Thi）为电化学探针，得到AFB1的LOD为0.01 fg/mL（图3C）。

邻苯二酚在电极表面可被氧化为邻醌产生电化学信号，故具有邻苯二酚结构的分子与MMNPs结合形成的电学复合标签属非酶型。Masoomi等［55］以具有邻苯二酚结构的3-（（2-巯基乙基亚氨基）甲基）苯-1，2-二醇改性的MMNPs为非酶型电学复合信号标签，结合AFB1抗体；同时在壳聚糖（CTS）和HAuCl4溶液中用柠檬酸三钠还原得到AuNPs，制备纳米金复合水凝胶壳聚糖（CTS/AuNPs），以CTS/AuNPs修饰电极，再通过酰胺键共价偶联AFB1抗体，通过免疫反应形成非酶夹心复合物，其对AFB1的LOD低至0.2 ng/mL（图3D）。

图3 基于光学［52-53］（A、B）、酶型电学［54］（C）、非酶型电学［55］（D）复合信号标签MMNPs的传感法检测Fig.3 Schematic illustrations of sensor for detecting mycotoxin based on optic［52-53］（A，B），enzymatic electrical［54］（C），non-enzymatic electrical［55］（D）complex signal label MMNPs

4 MMNPs应用——修饰界面

电传感法可应用于多种形态的MMNPs修饰界面，例如常见的球状、棒状及纤维状，能有效提高传感界面的比表面积、稳定性和导电性等，优化分析性能。MMNPs通过磁力修饰电极界面，作用力强且便于修饰，是修饰界面的良好材料。

4.1球状MMNPs

球状MMNPs以抗原、抗体或Apt改性后可用于修饰电极，检测靶标浓度。Wang等［56］以多孔MMNPs修饰电极，并通过生物素-链霉亲和素反应结合大量抗体，直接捕获ZEN，利用循环伏安法得到其LOD为3.7 pg/mL。

4.2棒状MMNPs

棒状MMNPs具有催化Thi电化学还原的活性，He等［57］利用棒状MMNPs与rGO共同修饰金电极，进一步电沉积AuNPs并连接DNAS2，以空心立方Pt@Au纳米骨架功能化聚乙烯亚胺（PEI）复合还原氧化石墨烯（hcPt@AuNFs/PEI/rGO）负载Thi为标签，连接DNAS1；ZEN与Apt结合，DNAS1－hcPt@AuNFs/PEI/rGO则通过与单链DNAS2杂交结合到电极表面，基于棒状MMNPs催化Thi还原产生的电信号进行检测，ZEN的LOD为0.105 pg/mL。

4.3 纤维状MMNPs

纤维状MMNPs是通过静电纺丝技术制备的磁性纳米纤维，比表面积显著增大。Xu等［58］以碳纳米角（CNHs）修饰磁性电极，其锥型结构可加快电子传输，放大鲁米诺的ECL信号；再将磁性纳米纤维固定于CNHs，并固定AFB1抗体。AFB1与AFB1抗体的结合将阻碍磁性电极表面的电子传输并降低鲁米诺的ECL信号，基于此对AFB1进行检测，其LOD为0.02 ng/mL。

5 MMNPs应用——混合应用

MMNPs的3种应用方式可混合使用，以最大程度发挥3种应用方式的优势，提高灵敏度，降低基质效应。已有报道使用MMNPs同时负载生物分子与信号标签应用于毒素的检测。如Guo等［59］将CdSe/ZnS量子点（OC－QDs）和油酸修饰的MMNPs（OA－MMNPs）封装到两个聚合物基质中，以形成的核/壳结构的双功能磁性荧光珠（MFBs）作为信号标签检测AFB1。此外，还可在MFBs表面连接抗体，通过特异性捕获AFB1作为固相载体，利用免疫层析分析法（ICA）对酱汁提取物和真正黑酱油中的AFB1进行检测，两者的LOD分别为3、51 pg/mL。凭借QD和MMNPs的综合优势，MFB作为ICA的信号标签具有巨大的潜力。

6 结论与展望

本文概述了基于MMNPs的真菌毒素的分析检测现状，重点阐述了MMNPs作为固定载体、信号标签和修饰界面的原理、优缺点及最新研究进展。MMNPs作为固定载体，其易分离性及高比表面积在检测应用中得到了广泛认可，但其表面活性位点有限，改性后超顺磁性降低，实际应用受限。开发新型改性材料、优化改性手段，增加其活性位点，保持良好的超顺磁性，显著改善固载与分离性能，进而提高检测灵敏度已成为当下热点问题。MMNPs作为信号标签和修饰界面进行应用时大都基于其表面效应和超顺磁性；对其纳米酶样活性的应用较少，其在各种特殊结构和类酶活性纳米材料的研制、复合、应用等方面，仍有较大的发展空间。此外，如何进一步将MMNPs的3种应用方式有机融合，构建集富集、分离与检测为一体的新的分析方法，将是未来提高实际样品中真菌毒素分析检测灵敏度和特异性的重点研究方向。