CLDN9与胃癌糖酵解水平的相关性及临床意义

韩延敏，李云荣，周而乐，宋 健，李 红，曹 璋，吴淑华

胃癌是常见的危害人类健康的恶性肿瘤，近年胃癌的手术治疗、化疗及靶向治疗等均取得较大进展，但是胃癌患者的术后5年生存率仍不理想[1-2]。研究表明，紧密连接蛋白(Claudin)与肿瘤的发生、发展、转移等密切相关[3]。CLDN9(Claudin-9)作为紧密连接的重要组成部分，其表达异常影响紧密连接的功能。CLDN9在多种肿瘤如肺癌、肝癌中表达异常，可作为评估肿瘤预后的指标之一[4-5]。新近研究表明，CLDN9与子宫内膜癌、食管腺癌的糖酵解水平相关[6-7]。目前，有关CLDN9与胃癌糖酵解水平的研究尚未见报道。本文通过检测CLDN9与葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)及糖酵解关键限速酶PKM2、LDHA在胃癌中的表达水平，分析CLDN9、GLUT-1、PKM2、LDHA与胃癌临床病理特征及预后的关系，着重探讨CLDN9和胃癌糖酵解水平的相关性，为胃癌的浸润转移机制及预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1临床资料 从TCGA基因库中筛选343例胃癌和30例正常胃黏膜组织中mRNA的表达数据及临床资料。收集2014年1月～2016年3月滨州医学院附属医院病理科存档的胃腺癌标本91例及相应癌旁正常胃黏膜组织，根据WHO(2019)消化系统肿瘤分类标准进行分类。所有患者术前均未经放、化疗及生物学治疗。其中，男性58例，女性33例，年龄44～83岁，中位年龄64岁；肿瘤直径1.2～11 cm，平均5.0 cm；分化程度：高分化17例，中分化34例，低分化40例；浸润深度：黏膜层或黏膜下层合计19例，肌层9例，浆膜下层及浆膜层63例；有淋巴结转移者61例，无淋巴结转移者30例。随访截至2021年3月或患者死亡。

1.1.2试剂 兔抗人CLDN9多克隆抗体购自Proteintech公司。兔抗人LDHA、PKM2多克隆抗体购自Abcam公司。兔抗人GLUT-1多克隆抗体和免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息学数据分析 登录TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)，获取343例胃腺癌和30例正常胃黏膜组织中mRNA表达数据，并下载患者临床数据。使用R-studio软件中的“edgeR”和“limma”对TCGA数据库来源的mRNA表达数据进行预处理，对CLDN9在胃腺癌及正常胃黏膜上皮组织中的表达进行比较。将从TCGA数据库下载的同一患者ID的mRNA基因数据与临床数据进行合并，以CLDN9基因表达的中位数为界，将胃癌患者分为高表达组与低表达组，使用R-studio软件中的“survival”和“survminer”制作Kaplan-Meier生存分析曲线，观察目的基因高、低表达差异对患者生存期的影响。

1.2.2免疫组化 采用免疫组化EnVision法染色，常规石蜡组织切片经二甲苯脱蜡至水，EDTA修复抗原，3% H2O2孵育去除内源性过氧化物酶，加入山羊血清封闭，滴加一抗CLDN9(1 ∶100)、PKM2(1 ∶100)、LDHA(1 ∶150)、GLUT-1，置于4 ℃过夜孵育。PBS洗涤2次后滴加二抗，37 ℃孵育30 min，洗涤后，DAB显色，苏木精复染，分化，脱水透明，中性树胶封固。

1.3 结果判定CLDN9、LDHA主要表达于细胞质，以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性；GLUT-1主要表达于细胞膜，以出现棕黄色颗粒为阳性；PKM2阳性为细胞质和细胞核中出现弥漫棕黄色颗粒。免疫组化结果判定采用半定量积分法，根据阳性细胞染色强度和阳性细胞百分比评分。(1)根据阳性细胞染色强度计分：无阳性着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；(2)根据阳性细胞百分比计分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项评分结果相乘作为最终结果：≥4分为阳性，<4分为阴性。

1.4 统计学分析采用SPSS 23.0软件、GraphPad Prism软件进行统计学分析，计数资料用率表示，资料分组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearson关联性分析，生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，采用Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析CLDN9 mRNA在胃癌中的表达及预后从TCGA数据库获取的25例配对胃腺癌组织中有18例CLDN9 mRNA的表达量明显高于正常胃黏膜上皮组织(图1)，差异有统计学意义(P=0.001 8)。根据CLDN9 mRNA表达的中位数(5.315)将343例胃癌患者分为低表达组和高表达组，Kaplan-Meier生存分析显示，CLDN9低表达组中位生存时间为1 294天，预后明显优于高表达组(649天，P=0.048，图2)。

图1 胃癌及配对正常胃黏膜组织中CLDN9 mRNA的表达量

图2 TCGA数据库中CLDN9 mRNA表达量对胃癌患者总生存期的影响

2.2 胃癌及癌旁正常胃黏膜组织中CLDN9、GLUT-1、PKM2和LDHA的表达免疫组化结果显示，CLDN9主要表达于细胞质(图3)，GLUT-1主要表达于细胞膜(图4)，PKM2主要表达于细胞质和细胞核(图5)，LDHA主要表达于细胞质(图6)，四者在癌旁正常胃黏膜组织的阳性率分别为8.2%(7/85)、1.1%(1/85)、16.4%(14/85)、14.1%(12/85)，在胃癌组织中的阳性率分别为65.9%(60/91)、61.5%(56/91)、86.8%(79/91)、78.0%(71/91)，均高于癌旁正常胃黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.001，图7)。

图3 A.正常胃黏膜组织中CLDN9呈阴性，EnVision法；B.胃腺癌组织中CLDN9呈阳性，EnVision法 图4 A.正常胃黏膜组织中GLUT-1呈阴性，EnVision法；B.胃腺癌组织中GLUT-1呈阳性，EnVision法 图5 A.正常胃黏膜组织中PKM2呈阴性，EnVision法；B.胃腺癌组织中PKM2呈阳性，EnVision法 图6 A.正常胃黏膜组织中LDHA呈阴性，EnVision法；B.胃腺癌组织中LDHA呈阳性，EnVision法

图7 胃腺癌及正常胃黏膜组织中CLDN9、GLUT-1、PKM2与LDHA的表达

2.3 胃癌中CLDN9、GLUT-1、PKM2和LDHA表达与临床病理特征的关系胃腺癌组织中CLDN9、GLUT-1表达与患者中位年龄、肿瘤浸润深度、淋巴结转移有关，差异有统计学意义(P<0.05)；PKM2表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移有关，差异有统计学意义(P<0.05)；LDHA表达与胃腺癌临床病理特征均无关(P>0.05，表1)。

表1 胃腺癌中CLDN9、GLUT-1、PKM2和LDHA表达与临床病理特征的关系

2.4 胃癌中CLDN9与GLUT-1、PKM2、LDHA的相关性分析根据免疫组化染色结果将91例胃腺癌分为CLDN9阳性组和阴性组，并分析其与GLUT-1、PKM2、LDHA表达的相关性。结果显示，CLDN9阳性组中GLUT-1、PKM2、LDHA的阳性率分别为70.0%、93.3%、85.0%，均高于CLDN9阴性组(45.2%、74.2%、64.5%)，差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关性分析显示，胃腺癌组织中CLDN9表达与GLUT-1、PKM2、LDHA表达均呈正相关(r=0.242，r=0.268，r=0.234)，差异均有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 胃腺癌中CLDN9与GLUT-1、PKM2、LDHA蛋白表达的相关性

2.5 预后91例胃癌患者中位生存时间为54个月，平均5年生存率为39.6%。Kaplan-Meier生存分析显示，胃腺癌患者预后与CLDN9、PKM2、LDHA、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、脉管侵犯、神经侵犯、淋巴结转移相关，CLDN9阳性胃癌患者比CLDN9阴性胃癌患者预后差，差异有统计学意义(P<0.05，图8)。Cox多因素回归模型分析显示，CLDN9、PKM2、肿瘤直径、脉管侵犯、神经侵犯均是胃腺癌患者预后的独立危险因素(P<0.05，表3)。

图8 胃腺癌预后生存分析：A.CLDN9预后生存分析；B.PKM2预后生存分析；C.LDHA预后生存分析；D.肿瘤大小预后生存分析；E.分化程度预后生存分析；F.浸润深度预后生存分析；G.脉管侵犯预后生存分析；H.神经侵犯预后生存分析；I.淋巴结转移预后生存分析

表3 胃腺癌患者预后Cox多因素分析

3 讨论

Claudin蛋白是细胞间紧密连接的重要组成成分，具有调节上皮细胞和内皮细胞间的防御和屏障功能，维持细胞间黏附、分化和极性，其异常表达能够导致紧密连接功能失常，影响细胞间的黏附，促进肿瘤的增殖、转移和复发[8]。Claudins是一个由至少27个成员组成的多基因跨膜蛋白家族，基本结构包括4个跨膜(TM)螺旋结构、2个细胞外环(ECLs)、1个N-末端和1个C-末端[9]。部分Claudin，如CLDN1、CLDN4、CLDN7、CLDN18.2已被证实与胃癌发生、发展相关。CLDN1在胃癌中表达上调，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，与患者预后不良相关，有望成为胃癌早期诊断的生物学标志物[10-11]。与正常胃黏膜组织相比，CLDN4在胃癌组织中表达降低，其表达与胃癌分化程度、侵袭、迁移呈负相关，CLDN4过表达预示患者具有更好的预后[12-13]。Wu等[14]研究发现CLDN7在胃癌组织中的表达明显升高，且CLDN7过表达可抑制E-cadherin的表达水平，促进胃癌细胞上皮-间质转化，增强肿瘤侵袭、转移能力。CLDN11在胃癌中因其启动子的高甲基化而表达下调，增强胃癌细胞的生长、增殖和迁移[15-16]。在正常组织中CLDN18.2仅在分化型胃黏膜上皮细胞中表达，并在胃黏膜上皮细胞恶性转化时被激活，在弥漫型胃癌中常高表达。目前，针对CLDN18.2的靶向药物IMAB362在临床试验中已取得较好的疗效[17-18]。

CLDN9是一种与细胞通讯连接发育相关的蛋白，在人听力中起至关重要的作用，其破坏会导致感音性神经听力损失[19]。CLDN9的破坏不仅影响机体的生理功能，在肿瘤进展期紧密连接功能的破坏会使细胞极性丢失以及细胞间的信号通路发生障碍。CLDN9在垂体瘤中的表达增加，且在侵袭性垂体瘤中CLDN9的表达水平高于非侵袭性垂体瘤，CLDN9的表达量增加与肿瘤侵袭性呈正相关[20]。CLDN9在肝细胞癌中表达上调，通过激活Tyk2/Stat3信号通路促进肝癌的侵袭、转移[4]。CLDN9过表达还与肺癌的转移密切相关，敲除CLDN9可显著抑制肺癌的转移[5]。Yu等[21]通过数据分析发现CLDN9在胃癌和正常组织中存在差异性表达，且在胃癌组织中表达上调。因此，本实验采用生物信息学技术和免疫组化分析CLDN9在胃腺癌和癌旁正常黏膜组织中的表达，结果显示CLDN9在胃腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常黏膜组织，并与肿瘤浸润深度、淋巴结转移等临床病理特征相关。目前，有关CLDN9与Claudin其它家族成员间的关系，在胃癌进展转移研究中尚未见报道。

肿瘤细胞通过代谢重编程能在营养匮乏的微环境下存活和增殖，其中糖代谢异常在维持肿瘤的恶性特征中发挥重要作用。肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下仍以糖酵解的方式获取生长增殖所必需的能量，而不是依赖于氧化磷酸化，肿瘤的这种特殊生物学特征被称为Warburg效应[22]。肿瘤糖酵解效率主要依赖蛋白质和糖酵解关键酶，尤其是GLUT-1、PKM2、LDHA。

GLUT-1与Warburg效应密切相关,是葡萄糖跨膜转运的重要载体，作为糖酵解的重要调节因子之一，下调GLUT-1会抑制葡萄糖的摄取和乳酸的产生，研究表明GLUT-1高表达对胃癌的发生、发展、转移、侵袭至关重要[23-25]。Xi等[26]发现GLUT-1在喉癌中表达上调，下调GLUT-1会抑制喉癌的增殖和转移。Yang等[27]通过荟萃分析发现GLUT-1与直肠癌T分期、淋巴结转移等临床病理特征呈正相关，提示GLUT-1过表达可能是结直肠癌预后不良的潜在生物学标志物。PKM2是丙酮酸激酶最常见的亚型，是糖酵解重要的调节点，通过将高能磷酸基团转移到ADP中，使磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸，从而生成ATP。PKM2被认为是肿瘤生长及代谢的重要调节因子，有研究表明在胃癌中敲除PKM2后抑制糖酵解水平，抑制了肿瘤细胞的增殖[28-31]。Kim等[32]发现细胞外PKM2激活EGFR-PKC导致CLDN1表达增强，从而促进结肠癌细胞的迁移能力。LDHA通过催化丙酮酸转化为乳酸促进糖酵解过程，降低肿瘤微环境的pH值，在胃癌中表达上调，促进肿瘤的迁移、侵袭[33]。Cai等[34]发现LDHA在口腔鳞状细胞癌中过表达，通过促进癌基因和上皮-间质转化促进口腔鳞状细胞癌进展。本实验通过对GLUT-1、PKM2、LDHA在胃腺癌中的表达及与胃腺癌临床病理特征的相关性进行分析，发现GLUT-1、PKM2、LDHA均在胃腺癌中高表达，且GLUT-1、PKM2表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移等相关。由此可见，胃癌中存在较高的糖酵解水平，产生有利于肿瘤生长的酸性微环境，促进肿瘤的发生、发展。

新近研究表明，CLDN9与肿瘤糖代谢具有相关性。Wang等[6]通过分析TCGA数据库中548例子宫内膜癌患者mRNA表达水平，发现CLDN9等9个基因与子宫内膜癌糖酵解水平及总生存率密切相关。Kang等[7]通过数据库分析CLDN9与食管腺癌糖酵解相关，常会导致预后不良。本实验结果显示胃腺癌组织中CLDN9与GLUT-1、PKM2、LDHA表达呈正相关，且在CLDN9阳性组中GLUT-1、PKM2、LDHA的表达均高于CLDN9阴性组。因此，我们认为CLDN9表达与胃癌糖代谢相关，为胃癌进展及转移机制研究提供理论支持。

CLDN9不仅与肿瘤细胞的增殖、侵袭有关，其高表达还会影响患者预后[35]。影响胃癌患者预后的因素诸多，有研究表明脉管侵犯可作为晚期胃癌及非转移胃癌患者预后的独立危险因素，且神经侵犯与胃癌不良预后关系密切[36-38]。本组结果表明CLDN9、PKM2、LDHA、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、脉管侵犯、神经侵犯、淋巴结转移均与患者预后相关，且CLDN9阳性者的生存率明显低于阴性者，与生物信息学分析结果一致；Cox回归模型分析显示CLDN9、PKM2、肿瘤直径、脉管侵犯、神经侵犯是胃腺癌预后的独立危险因素。由此推测，高表达的CLDN9影响肿瘤的生物学行为，参与肿瘤糖酵解的调控，抑制其表达可能会延长患者生存时间，改善患者预后。CLDN9有望成为提示胃癌患者预后不良的生物学标志物，对临床治疗策略有一定的指导意义，但其生物学机制仍需要进一步分析。

总之，本实验结果表明CLDN9、GLUT-1、PKM2及LDHA在胃腺癌组织中表达上调，CLDN9、GLUT-1及PKM2表达均与肿瘤浸润深度、淋巴结转移等临床病理特征有关，且CLDN9、PKM2作为胃腺癌预后的独立危险因素，其高表达提示患者预后不良。CLDN9表达可能与肿瘤糖代谢相关，在胃癌进展中起重要作用，有望成为胃癌诊断和治疗的新靶点。