丹参-川芎药对治疗脑梗死作用机制的网络药理及分子对接研究

李露露，宋圆英，胡馨予，卢云

(1.成都中医药大学，四川 成都 610075；2.成都中医药大学附属医院,四川 成都 610075)

脑梗死(Cerebral Infarction，CI)又称缺血性脑卒中，是因脑部血液循环障碍导致脑组织局限性缺血、缺氧坏死，使机体出现偏瘫、失语、认知功能障碍等神经功能缺损症状，具有病死率、致残率、复发率高的特点，是危害人类健康的重大疾病之一[1]。世界卫生组织2015年发布的全球非传染性疾病状况报告中指出，每年约1 750万人死于非传染性疾病，其中约670万人死于中风[2]。目前西医对该病的治疗以对症治疗为主，包括降压、降脂、抗凝、抗血小板聚集、抗炎和营养支持等，但部分患者治疗效果不佳。近年来，随着对中医药研究的不断深入，中西医结合治疗方式在改善脑梗死患者神经功能，减轻其临床症状等方面发挥了重要作用[3]。

中医认为CI属于“中风病”范畴，以元气亏虚为本，虚、瘀、痰、火、风夹杂，最终导致机体阴阳失调、气血逆乱[4]。中医药在CI治疗中发挥着重要作用[5]，药对作为方剂组成核心部分是复方药理研究的重要内容，惠小珊等[4]在对脑梗死中药复方专利用药配伍规律的研究中发现，丹参-川芎是其中最常用的药对。丹参味苦，性微寒，功能活血止痛、祛瘀生新、除烦安神；川芎味辛，性温，功能活血行气、祛风止痛[6]。现代药理学研究表明丹参提取物可透过血脑屏障，发挥抗凋亡、促进神经血管再生等作用[7]；川芎提取物可能通过抑制NF-κB信号通路的激活发挥对脑缺血损伤的保护作用[8]。该药对发挥治疗效果的具体作用机制尚不清楚，有待进一步研究。

本文基于网络药理学方法和分子对接机制研究丹参-川芎药对治疗脑梗死的关键靶点和作用机制，为日后的进一步研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 筛选丹参-川芎药对有效成分及其作用靶点

分别以“丹参”“川芎”为搜索词在中药系统药理数据库及分析平台TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中进行检索，设置生物口服利用度(OB)≥30%、化合物类药性(DL)≥0.18为阈值，得到丹参、川芎有效成分。在Related Targets列表下获取整理有效成分作用靶点，使用Uniprot数据库将得到的靶点名进行标准化转换，获取其简称。

1.2 筛选获取疾病相关靶点

以“cerebral infarction”为检索词，在GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/)数据库中进行检索，去除重复项获得与脑梗死相关的靶点。

1.3 获取药物和疾病共同靶点并构建蛋白相互作用网络

绘制韦恩图得到药物和疾病共同作用靶点，使用cytoscape软件构建药物有效成分-疾病-靶点网络图。在String(https://string-db.org/)数据库中导入二者共有的靶蛋白，构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络，其中“Homo sapiens”为蛋白种属、“medium confidence>0.4”为相互作用阈值。

1.4 关键靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析

将关键靶点导入DAVID数据库进行基因本体(GO)生物学功能过程分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，设置P<0.5为阈值，可视化处理后分析丹参-川芎药对治疗脑梗死可能涉及的分子功能和信号通路。

1.5 分子对接

利用AutoDock Vina软件对丹参-川芎药对三个主要成分MOL000006(Luteolin,木犀草素)、MOL007154(Tanshinone iia,丹参酮ⅡA)、MOL007088(Cryptotanshinon，隐丹参酮)和核心靶点EGFR、MYC、VEGFA进行分子对接实验，从而验证其相互间的作用活性。首先在TCMSP软件上下载主要化合物的结构文件，从PDB网站(http://www.rcsb.org/)下载核心靶点蛋白的pdb文件，利用AutoDock Tools对上述配体和受体进行常规处理，利用Autogrid得到对接活性位点，用AutoDock Vina进行分子对接，得到结合能(Affinity)。查阅大量文献，以结合能≤-5 kJ/mol为分子与靶点结核性较好的筛选标准，结合能越小对接越好[9-11]。

2 结果

2.1 丹参-川芎药对有效成分及其作用靶点

设置阈值OB≥30%，DL≥0.18后，共筛选出丹参-川芎药对有效成分72种，其中丹参65种，川芎7种，具体内容见表1。

表1 丹参-川芎药对有效成分

2.2 药物有效成分和疾病共同靶点预测结果

在TCMSP数据库平台筛选获取药物有效成分靶点61个，在GeneCards和OMIM数据库共获取疾病相关靶点3 110个，将药物有效成分靶点和疾病靶点进行交集分析，得到共同作用靶点47个，具体内容见表2。利用Cytoscape软件构建药物有效成分-疾病-靶点网络(图1)，共包含105个节点和397条边。利用中心度值(Betweenness Centrality)和等级值(Degree)进行排序，得到排名靠前的化合物分别为MOL000006(luteolin,木犀草素)、MOL007154(tanshinone iia,丹参酮ⅡA)、MOL007088(cryptotanshinone,隐丹参酮)、MOL007049(4-methylenemiltirone，4-亚甲丹参新酮)和MOL007100(dihydrotanshinlactone,二氢丹参内酯)。通过string数据库对共有靶点构建PPI网络，设置相互作用阈值为中等(medium confidence>0.4)，得到47个节点和311条互作边(图2)。使用R软件绘制Barplot条形图进行计数，发现排名靠前的作用靶点是EGFR、MYC、VEGFA、GASP3、IL6等(见图3，其中左列为基因名，如EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor,表皮生长因子受体；数字为相应基因临近节点数目，如EGFR相应节点数目为29)。

图3 丹参-川芎药对治疗脑梗死互作关系barplot图

表2 丹参-川芎药对和脑梗死47个共同作用靶点

图1 丹参-川芎药对有效成分-疾病靶点图

图2 丹参-川芎药对潜在靶点的相互作用网络图

2.3 GO和KEGG富集分析结果

将关键靶点导入DAVID数据库(P<0.05)，进行GO功能富集分析，得到生物过程(Biological Process，BP)条目426个，细胞组成(Cell Composition，CC)条目45个，分子功能(Molecular Function，MF)条目52个。按P值排序将前20条绘图表示，其中点越大表示富集基因数越多，颜色越红表示药物对疾病的干预越密切，主要涉及泛素样蛋白连接酶结合、类固醇结合、转录因子结合、转录调控DNA结合、RNA聚合酶Ⅱ特异类固醇正调控、核受体活性、G蛋白耦联胺受体活性等分子功能和生物过程(图4)。对关键靶点进行KEGG通路富集分析，得到31条信号通路，按P值排序将前20条绘图表示，主要涉及PI3K-AKT、TNF、AGE-RAGE以及癌症等通路(图5)。

图4 GO功能分析气泡图(前20)

图5 KEGG通路分析气泡图(前20)

2.4 分子对接结果

使用AutoDock Vina软件对丹参-川芎药对中排名前三的活性成分和关键靶点EGFRA、MYC、VEGF进行分子对接。结合能小于0表明药物分子和靶点能够发生结合，结合能小于≤-5 kJ/mol表明分子与靶点结合性较好，结合能越小则对接越好[9-11]。对接结果表明药物主要有效成分luteolin(木犀草素)、tanshinone iia(丹参酮ⅡA)、cryptotanshinone(隐丹参酮)与核心靶点EGFR、MYC、VEGF之间结合性较好，具体对接结果见表3。图6～8为对接最好的组合，包括luteolin和MYC、tanshinone iia和VEGFA、4-methylenemiltirone和VEGFA。其中luteolin与MYC活性位点TYR-295、GLU-321、ASN-332、THR-337形成氢键作用，tanshinone iia与VEGFA活性位点ASP-276、LYS-286形成氢键作用，cryptotanshinone与EGFR活性位点VAL-34、TYR-36、CYS-32形成氢键作用，这些氢键是促进结合到活性位点的主要作用力[12]。

图6 MYC和luteolin

表3 核心蛋白与化合物对接结果

3 讨论

脑梗死在脑血管病中占据重要组成部分，丹参、川芎作为活血行气、祛瘀生新的常用中药，在脑梗死的治疗中被广泛运用。丹参的水溶性提取物丹参多酚酸、复方制剂丹参川芎嗪等更是在脑梗死治疗中效果显著。目前，大量研究显示丹参-川芎药对能够改善脑组织缺血、抗炎、抗细胞凋亡、促进血管神经再生，在改善患者预后方面发挥着显著作用[13-16]。

本次研究中药物有效成分和疾病靶点网络显示，丹参-川芎药对的主要成分木犀草素(luteolin)、丹参酮ⅡA (tanshinone iia)、隐丹参酮(cryptotanshinone)、4-亚甲丹参新酮(4-methylenemiltirone)和二氢丹参内酯(dihydrotanshinlactone)是网络中的重要节点，提示这些化合物在丹参-川芎药对中发挥治疗脑梗死的重要作用。

研究表明，木犀草素作为一种天然存在的四羟基黄酮化合物，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、保护血脑屏障通透性等作用[17-19]。其抗炎机制可能是通过抑制NF-κB信号通路激活从而降低促炎介质一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产生发挥作用[20-21]，最近的研究还发现木犀草素通过抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)激活PI3K/Akt信号通路，下调细胞凋亡，提高细胞存活率，并减少梗死体积[22]。丹参酮ⅡA是丹参中发现的一种亲脂性化学物质，既往的研究证实其对局灶性脑缺血和局灶性脑缺血/再灌注损伤具有保护作用，能够扩张脑血管、改善微循环、减少梗死灶面积，从而实现改善脑梗死导致的脑功能代谢障碍[23-25]。研究发现，丹参酮ⅡA能够上调梗死区Bal-2蛋白水平并下调Bax蛋白水平，发挥抗凋亡作用，并且能抑制梗死区海马和皮质中IL-6、TNF-α、CRP水平以减轻炎症反应[26]。目前常用的丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)能够减弱自噬相关蛋白LC3-11、Beclin-1和Sirt的上调水平，从而发挥减轻神经炎症、改善神经功能缺损的保护作用[27]。隐丹参酮是丹参中的脂溶性提取物，可透过血脑屏障干预β淀粉样蛋白所形成的脑损害，还能够通过调节线粒体凋亡细胞信号途径发挥对神经细胞的保护作用，并且其提高线粒体膜电位、抑制细胞毒性的功能实现和PI3K-Akt信号通路密切相关[28]。在对缺血/再灌注大鼠的研究中发现，隐丹参酮可降低损伤大鼠神经功能缺损行为学评分，减少脑梗死体积，通过抑制Caspase-3、miR-210表达上调来实现抗细胞凋亡、减少超氧化物产生的功能[29]。以上结果说明丹参-川芎药对的主要成分可以通过多种途径相互协同在脑梗死的治疗中发挥作用，目前关于4-亚甲丹参新酮在治疗脑梗死的研究中还很少得到报道，值得未来研究对其进行关注。

通过匹配药物靶点和疾病靶点并构建蛋白互作网络得出丹参-川芎药对治疗脑梗死相关靶点47个，进一步分析发现EGFR、MYC、VEGFA、GASP3、IL6这五个靶点在治疗网络中占据重要地位，表明其可能是丹参-川芎药对治疗脑梗死的重要靶点。表皮生长因子受体(EGFR)基因和细胞增殖、代谢密切相关，当表皮生长因子(EGF)与其结合时，EGFR被激活参与MAPK家族和PI3K/Akt信号通路传导，影响细胞存活循环周期，从而在脑梗死后的神经保护中发挥重要作用[30-31]。研究显示促进脑梗死后神经发生可以改善神经功能预后，减轻病情，而EGFR在调控脑梗死后室管膜下区(SVZ)的神经干细胞(NSCs)增殖和分化、促进神经发生过程中至关重要[32],但其具体机制尚不明确。MYC基因是较早发现的一组类癌基因，包括C-myc、N-myc、L-myc，其中N-myc下游调控基因(NDRG)家族成员在应激反应、细胞增殖、肿瘤基因调控中扮演重要角色[33]，其家族成员NDRG1可能通过Raf-ERK通路促进缺氧细胞生长，延长其应对缺氧的时长，从而发挥对神经细胞的保护作用[34]。NDRG2在星形胶质细胞中广泛表达，参与调节星形胶质细胞的活化状态，具有稳定血脑屏障、传递神经突触间信息、调节脑血流量等重要生理功能[35]。血管内皮生长因子A(VEGFA)作为众所周知的缺氧诱导因子(HIF)靶基因，是促进血管新生的一个重要调节基因[36]。通过与其受体VEGFR2结合，能够经Ras/MAPK途径传导，刺激细胞内皮增殖、迁移并维持细胞活性[37]。研究表明，在短暂性大脑中动脉闭塞的急、慢性期，VEGFA能通过上调脑缺血再灌注损伤后缺血区血管性血友病因子水平，促进血液循环从而改善脑梗死后的神经功能缺损症状[38]。本研究显示丹参-川芎药对治疗脑梗死的关键治疗靶点集中在对血管生成的调控作用上，提示其治疗作用和促进脑组织血管生成、改善缺血区血流供应密切相关。值得注意的是，研究还显示治疗靶点和癌症关系密切，癌症在中医属癥瘕积聚的范畴，脑梗死本质上属气虚血瘀致有形之块聚集，和癌症有共通之处，中医“异病同治”的思想得以体现。

图7 VEGFA和tanshinone iia

图8 EGFR和cryptotanshinone

GO和KEGG富集分析结果显示，丹参-川芎药对治疗脑梗死主要涉及泛素样蛋白连接酶结合、类固醇结合、转录因子结合、转录调控DNA结合、RNA聚合酶Ⅱ特异类固醇正调控、核受体活性、G蛋白耦联胺受体活性等分子功能和生物过程，这些生物学过程在药物治疗脑梗死的机制通路中都有所体现。关键靶点主要富集于PI3K-AKT信号通路[21]、TNF信号通路[39]以及一些癌症通路等。其中病毒感染的通路涉及Caspase-3 和 NF-κB，可对细胞凋亡、炎症反应起调节作用[9,40]；PI3K-AKT信号通路富集效果明显，提示其可能是丹参-川芎药对治疗脑梗死的核心通路，值得重点进行研究。先前各实验研究中发现川芎具有较强的扩血管、改善循环、减轻神经元损伤的作用[41]，周蕙芬等[42]在丹参-川芎药对的实验研究中发现其能够抑制炎症级联反应，减少海马神经元细胞TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的增加。以上研究结论和本次网络药理的结果具有一致性，表明此次研究结果较为可靠。GO和KEGG富集分析的结果表明丹参-川芎药对的活性成分通过多种途径发挥治疗脑梗死的作用，这些通路和通路之间的协同关系都可以为以后的研究提供方向。分子对接结果显示，丹参-川芎药对的活性成分与MYC、EGFR、VEGFR的亲和力较好，其化合物对疾病治疗的有效性仍需进一步的实验验证。

4 结论

本研究通过网络药理学方法对丹参-川芎药对治疗脑梗死的作用机制进行探究，认为其可能通过促进血管生成、抗细胞凋亡、抗炎等途径改善梗死区神经功能缺损情况，为了解丹参-川芎药对治疗脑梗死的机制提供了理论依据。考虑到基于网络现有数据分析的局限性以及药物在煎煮过程中的互相作用，目前结果可为后续研究提供参考方向，但是具体的结果仍需进一步实验验证。