金甲豆质量标准初步研究

吴恒，黎坤，卞金辉▲，吕光华

(1.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学 民族医药学院，四川 成都 611137)

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

齐墩果酸(纯度≥98%，成都普思生物科技有限公司，批号：PS012022)；浓硫酸(分析纯，成都市科隆化学品有限公司，批号:20150908)；香草醛(分析纯，成都市科隆化学品有限公司，批号：100093-20190905)。其他试剂均为分析纯。金甲豆样品共收集10个批次，分别来自安徽、四川、云南、西藏等地，具体信息见表1。经成都中医药大学吕光华教授鉴定为豆科菜豆属植物棉豆(PhaseoluslunatusL.)的干燥果实。

表1 10批金甲豆样品来源

1.2 仪器与设备

UV6300PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)，SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，KH-250DB 型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，ML304T电子天平(精度 0.1 mg，塞斯多利科学仪器(北京)有限公司)。

2 实验方法和结果

2.1 薄层鉴别

取各批药材，粉碎，过3号筛，称取粉末2 g，加70%乙醇40 mL，超声处理45 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取2次，每次20 mL；合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇10 mL使溶解，再加入盐酸1 mL，加热回流2 h，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[12]。另取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。按《中国药典》2020年版(四部)通则0502薄层色谱法试验。吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-甲酸(10 ∶2 ∶0.05)为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，详见图1。由图可知，以齐墩果酸作为对照品，斑点清晰，分离度好，无边缘效应。

注：1～10为金甲豆药材；S为齐墩果酸对照品

上述实验结果表明，以齐墩果酸为对照品建立的薄层色谱法稳定可靠，斑点清晰，鉴别特征明显，可用于金甲豆的定性鉴别。

2.2 含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称量齐墩果酸对照品适量，加无水乙醇溶解，制成每1 mL含齐墩果酸200 μg的溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约2 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇40 mL，称定重量，超声提取45 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 测定波长的选择 精密量取对照品溶液0.20 mL于10 mL带塞的试管中，置于80 ℃水浴锅中蒸干溶剂，再向试管中依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸0.7 mL，混匀后在55 ℃水浴锅中加热20 min,之后用自来水流水进行冲洗冷却，再加入5 mL冰醋酸，塞好上下颠倒摇匀。以不加对照品为空白对照,用紫外分光光度计在400～600 nm下进行吸收峰扫描。结果显示在550～560 nm波长处有最大吸收，与参考文献一致[13]。故测定波长选定为560 nm，详见图2。

图2 齐墩果酸对照品的紫外扫描图

2.2.4 提取溶剂的考察 取本品粉末(YD08)，分别加水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、甲醇，超声提取，测定吸光度，计算总三萜及甾醇含量，结果见表2。根据测定结果，采用70%乙醇和甲醇提取时，总三萜及甾醇的提取效率较高。因考虑到绿色化学的原则，选择70%乙醇为提取溶剂。

表2 提取溶剂的考察(n=2)

2.2.5 提取方法及时间的考察 取本品粉末(YD08)，80 ℃回流处理1 h或超声提取35、45、55、65 min，测定吸光度，计算总三萜及甾醇含量。结果表明，超声提取比回流提取的提取率高，而超声45、55和65 min无明显差异。因此，选择超声45 min为本品的提取方法(见表3)。

表3 提取方法及时间的考察(n=2)

3 方法学研究

3.1 线性关系考察

吸取对照品溶液0.01、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mL于10 mL带塞的试管中，置于80℃水浴锅中蒸干溶液，再向试管中依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸0.7 mL，混匀后在55 ℃水浴锅中加热20 min，之后用自来水流水进行冲洗冷却，再加入5 mL冰醋酸，塞好上下颠倒摇匀。以不加齐墩果酸对照品为空白对照。用紫外分光光度计在560 nm下测量吸光度值，结果见表4。再以吸光度值(A)为纵坐标，齐墩果酸浓度(μg/mL)为横坐标，进行回归，得回归方程。结果表明：齐墩果酸在含量为2～80 μg/mL之间时，与吸光度值线性关系良好。

图3 齐墩果酸标准曲线图

3.2 精密度试验

精密量取齐墩果酸对照品溶液(含齐墩果酸41.36 μg/mL)0.20 mL，操作方法同上，在 560 nm处测定吸光度值，共6次，计算仪器精密度，RSD为0.03%。表明仪器的精密度良好。

3.3 重复性试验

精密称取本品(批号YD08)2 g，共6份，照拟订的方法进行实验，测定吸光度，并计算含量，6份重复测定的RSD为1.92%。结果表明，本方法重现性良好。

3.4 加样回收试验

精密吸已知浓度的对照品溶液(8.28、8.52 mg/mL)10 mL，各3份，分别置100 mL具塞锥形瓶中，在水浴上挥干乙醇。取已知含量的金甲豆样品(批号YD07,含量为8.62 mg/g)粉末约1 g，共6份，置上述锥形瓶中，照拟定方法进行供试品溶液制备和测定，记录吸光度值，并计算回收率，结果见表4。结果表明，回收率在95.51%～99.95%之间，RSD为1.82%，该方法准确度良好。

表4 总三萜及甾醇加样回收试验结果

3.5 稳定性试验

取对照品溶液和供试品溶液，在制备后0、2、4、6、8、12 h时按上述条件进行显色，用紫外可见分光光度计测量吸光度，考察其吸光度的变化情况，RSD分别为1.06%和1.24%。结果表明，对照品溶液和供试品溶液在12 h内稳定。

3.6 样品测定

按照拟定的方法，对收集的10份样品进行测定，总三萜及甾醇含量平均值为8.01 mg/g，结果见表5。

表5 10批金甲豆总三萜及甾醇含量测定结果(n=2)

(见续表5) 续表5

上述实验结果表明，以齐墩果酸为对照品，通过紫外可见光-分光光度法建立的含量测定方法准确可靠，稳定性强，可供金甲豆含量测定使用。

4 讨论

本研究对薄层鉴别中供试品溶液的制备方法进行了考察。考虑到齐墩果酸在植物中可能以三萜皂苷的形式存在[14]，而酸水解可以释放齐墩果酸苷元[15]，且研究表明金甲豆中的皂苷元以齐墩果酸和大豆皂醇为主[7]。于是采用了70%乙醇超声提取、70%乙醇超声提取后经酸水解和70%乙醇超声提取后经正丁醇萃取后再酸水解等不同制备方法进行考察。结果发现，未经酸水解步骤的供试品溶液的齐墩果酸斑点十分微弱，经酸水解步骤后大大加强了斑点的强度，但其他斑点也会增加，干扰齐墩果酸主斑点，而水饱和正丁醇萃取这一步骤可以去除大量干扰斑点。因此，最终选用了以70%乙醇超声提取，经水饱和正丁醇萃取，再经酸水解后的样品溶液作为供试品溶液。

本研究以齐墩果酸为对照品，考察了不同展开剂、提取溶剂和方式、点样量等因素对薄层鉴别的影响，并进行了耐用性研究，最终选择以甲苯-丙酮-甲酸(11∶2∶0.05)为展开剂，在温度25 ℃，湿度58%时，展开效果最好。各批药材与对照品(齐墩果酸)在相同位置显示相同斑点，斑点清晰，重复性好。

由于大多数三萜类成分无共轭体系，处于紫外末端吸收或无吸收，在使用高效液相测定响应值较低，所以选择了紫外可见光-分光光度法来对总三萜及甾醇进行含量测定[16-17]。在金甲豆的含量测定中，检测波长为560 nm，齐墩果酸在含量为2～80 μg/mL范围内时，与吸光度值线性关系良好。平均回收率为97.48%，RSD=1.82%，符合《中国药典》的要求[18]，可作为金甲豆中总三萜及甾醇的含量测定方法。本研究后续将运用LC-MS等高灵敏、高准确度的检测方法对金甲豆中的三萜成分进行深入研究，继续完善、提升其质量标准。

综上所述，本研究选取了齐墩果酸为对照品对藏药金甲豆的质量标准进行了科学、系统的研究，在此基础上首次建立了金甲豆质量标准体系。金甲豆薄层色谱鉴别和含量测定方法简单快速、结果可靠、稳定性好、专属性强，可作为今后金甲豆临床应用、市场流通、产品开发的检验检测依据。