白细胞介素-22基因多态性与小儿支气管哮喘易感性的关系分析

王 艳 杨德彬

支气管哮喘为气道炎症以及气道重塑类慢性炎症性疾病，其中涉及多种细胞以及因子，多表现为呼吸困难、咳嗽、胸闷等症状，且呈现反复发作特点，在儿童群体发病率逐年上升，严重影响患儿健康以及发育[1-2]。研究[3]显示，支气管哮喘发病原因众多，环境以及遗传因素在发病过程中发挥重要作用，哮喘呈现出显著遗传易感性。基因技术发展使单核苷酸多态性逐渐成为遗传分子研究重点，目前已知哮喘发生与1 000多个基因有关[4]。研究[5]显示哮喘患者白介素-22 (interleukin-22, IL-22)水平高于健康人群，而IL-22基因多态性与儿童支气管哮喘的关系尚需要进一步研究。本研究拟探究IL-22基因多态性与小儿支气管哮喘关联性，为今后哮喘遗传易感性研究提供参考依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择2019年6月至2021年6月郑州大学附属儿童医院收治的86例支气管哮喘患儿作为研究组，以同期在该院体检且健康的74例儿童作为对照组。纳入标准：①研究组参照《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》中的标准[6]诊断存在支气管哮喘；②所有儿童均完成了研究中所有检查；③患儿家属同意参与研究，且研究进行符合《赫尔辛基宣言》中对应伦理学标准。排除标准：①近期存在呼吸道、泌尿系统及其他部位感染；②近期应用免疫抑制剂或者糖皮质激素；③免疫系统功能异常或者合并过敏性紫癜等免疫性疾病者；④心脏、肝肾等重要器官功能异常者；⑤有过敏史或者三代直系亲属中有哮喘发病史。研究组中男性48例，女性38例，年龄3～8岁，平均(6.12±1.24)岁，身体质量指数14.5～16.8 kg/m2，平均(15.22±0.46)kg/m2，城市67例，农村19例；对照组中男性44例，女性30例，年龄3～7岁，平均(5.84±1.18)岁，体质量指数14.2～16.9 kg/m2，平均(15.15±0.63)kg/m2，城市与农村分别60例与14例。两组研究对象一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 IL-22基因多态性分析 每例研究对象各抽取晨起空腹手肘部位静脉血2 mL置于含有肝素钠抗凝试管中，全血DNA抽提应用基因组DNA提取试剂盒(北京宜科思源科技有限公司)，按照试剂盒说明书进行操作，引物设计由上海生物工程有限公司负责，rs1179251位点(86 bp),上游：3’-ACCTGCATTCTAGCCCTATCTC-5’;下游：3’-AACTGGTTGGGATCTTAGCTTGTC-5’；rs2227484位点(117 bp)：上游：3’-TGCTGAATTCTAAACCAGACTTAT-5’，下游：3’-ACTTCTGCCTTAATTGTTATG ATC-5’；rs2227485位点(104bp),上游：3’-GTTTTGTCTTAGTAGAGTTCAGA-5’;下游：3’-ATAAAGCTGGTAGGAAAATGAGTC-5’。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)反应条件：95℃预变性处理10 min、95℃变性处理30 s、62℃变性处理30 s、72℃退火处理45 s，进行35个循环后，在75℃下进行10 min延伸处理。位点基因多态性应用单核苷酸多态性基因分型试剂盒(美国赛默飞世尔科技有限公司)进行检测。

1.2.2 血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平测定 收集研究对象晨起空腹手肘部位静脉血2 mL，离心获得上清液，应用酶联免疫吸附试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)测定血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平，按照试剂盒说明书进行检测。

1.2.3 支气管哮喘患儿临床表型评估 依据研究组患儿诱导痰细胞学检查结果，将患儿分为中性粒细胞亚组和嗜酸粒细胞亚组，参照中华医学会呼吸病学会所提出相关标准[7]进行测定，将中性粒细胞≥61%患者归入中性粒细胞表型组，嗜酸粒细胞≥3%患者纳入嗜酸性粒细胞表型组。

1.3 观察指标 比较两组研究对象各位点基因型频率观察值与期望值，基因型以及等位基因频率分布情况，比较两组研究对象血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平。

2 结果

2.1 两组对象各位点Hardy-Weinbery平衡检验 研究组与对照组对象rs1179251、rs2227484、rs2227485基因型频率分布符合Hardy-Weinbery平衡，位点基因型分布观察值与期望值差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组对象各位点基因型频率观察值与期望值比较[例(%)]

2.2 两组对象各位点基因型以及等位基因频率分布情况比较 研究组患儿rs1179251位点CC、CT基因型、rs2227485位点GG基因型检出率高于对照组(P<0.05)；两组对象rs1179251位点TT基因型，rs2227484位点CC、CG、GG基因型，rs2227485位点GA、AA基因型检出率比较差异无统计学意义(P>0.05)；两组对象rs1179251、rs2227484、rs2227485位点等位基因频率分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。rs1179251位点CT基因型(OR=0.589，95%CI：0.378～0.918)、T等位基因(OR=0.658，95%CI：0.456～0.950)，rs2227485位点GA基因型(OR=0.658；95%CI：0.466～0.929)与哮喘发病风险降低有关。见表2。

表2 两组对象各位点基因型以及等位基因频率分布情况比较[例(%)]

2.3 两组对象血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平比较 研究组患儿血清IL-22、IL-22R水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组对象血清IL-10R水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组对象血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平比较

2.4 不同IL-22位点基因型哮喘儿童血清指标水平比较 rs1179251位点CC基因型患儿血清IL-22、IL-22R水平高于CT+TT基因型患儿(P<0.05)，rs2227485位点GG基因型患儿血清IL-22、IL-22R水平高于GA+AA基因型患儿(P<0.05)，rs1179251位点CC基因型与CT+TT基因型患儿、rs2227485位点GG基因型与GA+AA基因型患儿血清IL-10R水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，rs2227484位点CC基因型患儿与CG+GG基因型患儿血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 不同IL-22位点基因型哮喘儿童血清指标水平比较

2.5 不同支气管表型患者IL-22基因多态性分析 嗜酸性粒细胞表型组儿童rs1179251位点CC、CT基因型、rs2227485位点GG基因型检出率高于中性粒细胞表型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 不同支气管表型患者IL-22基因多态性分析

2.6 不同支气管表型患者血清指标水平比较 血清IL-22、IL-22R水平高于中性粒细胞表型组(P<0.05)，不同表型儿童血清IL-10R比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 不同支气管表型患者血清指标水平比较

3 讨论

支气管哮喘为儿童群体常见气道慢性炎症性疾病，虽然患者在接受标准疗程吸入激素治疗以及支气管扩张剂治疗后病情可以显著改善，但是依然有部分患者治疗效果不佳，而这一现象在儿童群体中更为显著，导致患儿病情迁延不愈，容易反复发作[8-9]。因此，深入探究支气管哮喘发病机制，为后期治疗靶点研究提供参考十分重要。IL-22为功能多样细胞因子，在不同疾病中可以发挥抑制或者促进炎症反应作用，与机体疾病发生、发展以及预后有关[5]。研究[10-11]显示，IL-22基因多态性在自身免疫性疾病以及炎症性疾病中发挥重要作用。IL-22能够通过激活转录激活因子以及Janus激酶信号转录转导子信号通路，减少上皮细胞增殖、促进上皮细胞增殖，在机体免疫防御中发挥重要作用，还可以通过上调促炎因子表达而放大机体炎症反应[12]。还有研究[13]报告IL-22基因rs1179251位点G等位基因是机体炎症并发症发生保护因素。一项针对人类免疫缺陷病毒感染研究[14]显示，rs2227513 A/G 基因型与人类免疫缺陷病毒感染有关，而与rs2227484位点以及rs2227485位点多态性无关。

本研究结果显示，rs1179251位点、rs2227485位点高于健康对照组，rs1179251位点CT基因型、T等位基因，rs2227485位点GA基因型可能与哮喘发病风险降低有关，提示rs1179251位点、rs2227485位点多态性可能与小儿支气管哮喘易感有关。此前研究[15]显示，IL-22与哮喘的发生关系密切，其可通过与气道平滑肌细胞和肺泡上皮细胞结合，从而在哮喘发生过程中发挥作用。此外，研究[16]发现哮喘患者痰液以及血清中IL-22水平显著高于健康者，提示IL-22水平高低与患者哮喘严重程度有关。本研究结果显示，研究组患儿血清IL-22、IL-22R水平均高于对照组，而两组研究对象血清IL-10R水平差异无统计学意义。 有研究[13]认为IL-22需要与IL-22R受体结合后才能被激活，因此其是否能够发挥作用主要与靶细胞中IL-22R受体存在多少有关，而是否涉及IL-10R尚需要进一步研究证实。本研究结果与该研究[18]结论基本一致。李志等[17]研究则认为哮喘发生初始阶段，IL-22会加速气道上皮细胞坏死速度，进而抑制上皮细胞分化增殖，促进机体气道炎症，而哮喘发生终末阶段，IL-22可能发挥保护气道组织作用。本研究结果显示rs1179251位点以及rs2227485位点基因型与血清IL-22、IL-22R水平关系密切，提示IL-22可能通过rs1179251位点以及rs2227485位点基因多态性，影响血清IL-22、IL-22R水平，进而介导患儿支气管哮喘发生。研究显示嗜酸性粒细胞长时间浸润是支气管哮喘发生主要原因，支气管哮喘患者嗜酸性粒细胞异常上升显示患者自身免疫能力减弱，机体炎症反应激烈[18-19]。本研究结果显示支气管哮喘患儿临床表型与rs1179251位点CC、CT基因型，rs2227485位点GG基因型，血清IL-22、IL-22R水平关系密切，显示IL-22基因位点多态性以及血清IL-22、IL-22R水平在支气管哮喘患儿临床表型中发挥重要作用，分析认为IL-22基因位点多态性会影响下游IL-22水平，进而影响机体炎症反应，使患儿出现不同临床表型。

综上，IL-22基因rs1179251位点以及rs2227485位点可能与小儿支气管哮喘易感有关，rs1179251位点CT基因型、T等位基因，rs2227485位点GA基因型能够降低哮喘发病风险，而rs1179251位点以及rs2227485位点多态性可能与患者血清IL-22水平、临床表型关系密切。本研究仅证实IL-22基因rs1179251位点以及rs2227485位点多态性可能与小儿支气管哮喘易感有关，但是其在不同地域、种族之间区别尚需要进一步研究证实，今后将增加研究样本量，验证IL-22基因多态性对小儿支气管哮喘发生及进展影响。