智能响应性改性氧化石墨烯纳米粒子的制备与性能表征

◎张伟丽

(商丘职业技术学院交通学院,河南 商丘 476100）

目前，化疗药物多种多样，但由于细胞的多药耐药性导致疗效低下，通常需要注射大量药物，在治疗癌症的同时，伴随着强烈的毒副作用。为了减少药物在输送过程中的渗漏，降低其毒副作用，各种形态与功能的纳米载体层出不穷，其中聚合物载药系统的包封稳定性好、尺寸可控、易于功能化，能较好地实现药物的输送与控释，尤其是纳米级的载体材料，其尺寸小，血管的渗透保留效应（EPR）高，能有效降低药物的毒副作用[1]。但由于许多纳米载体无法被生物降解，导致其穿过胶原基质进入肿瘤血管中、到达肿瘤深处的药量不足，疗效不理想。此外，许多纳米载体虽包封效果好，能有效减少药物的外渗，但进入肿瘤细胞后，药物的释放能力差，在所需的治疗浓度下，细胞内药物积累有限，导致抗肿瘤效果不佳。因此，需要设计一种智能响应性纳米载体，在肿瘤的病理环境刺激（高温、酸性）或外源刺激（温度、电场/磁场、光）下，展现智能响应性行为，实现靶向给药。

光热疗法是一种无创的癌症治疗手段，当含有光热剂的纳米载体进入肿瘤细胞时，通过局部光照射，光热剂将通过光热转换，提高肿瘤细胞局部温度，从而杀灭细胞[2]。这种方式可增加抗癌药物的靶向特异性，降低其毒副作用。在众多的光热剂中，金的光热转换能力强，用途最广，因此，许多科研工作者致力于研究不同形态[3]的金纳米载体。如今，石墨烯，一种具有多环芳烃表面结构的二维碳纳米材料，也可将近红外光的能量高效转换为热能。作为一种良好的光热剂，石墨烯在抗菌与抗癌领域中都具有广阔的应用前景[4]。作为石墨烯的衍生物，氧化石墨烯制备成本低，在大规模应用中更具潜力。同时，氧化石墨烯由石墨烯经部分氧化制得，极性较强，可通过静电相互作用提高对某些抗癌药物的装载能力，且GO 携带-COOH，在药物控释过程中将对酸性环境产生响应，加速药物的释放。然而，作为一种无机材料，GO 胶体稳定性较差，在静脉注射时容易团聚[5]。纯GO 与某些药物间的作用过强也会降低药物的释放率[6]。因此，可利用亲水性纳米凝胶修饰GO，这种方式不仅可改善其胶体稳定性，纳米凝胶柔韧的结构也可快速对外界刺激产生响应[7]。此外，纳米凝胶的结构与软组织/细胞相似，其组织穿透性及细胞摄取率将优于其他载体材料[8]。

在还原性交联剂BAC、乳化剂十二烷基硫酸钠（SDS）及引发剂过硫酸钾（KPS）与促进剂NaHSO3的存在下，通过原位聚合法，将GO 包裹于温敏性聚合物PNIPAM 的三维网状结构中，制备了生理稳定性强、光热效应显著的GO@PNIPAM NPs，并分别在不同温度下（25～45℃）、不同酸碱度（pH=7.4、6.5 或 5.0）、808nm近红外光（NIR） 照射的条件下监测了GO@PNIPAM NPs 在模拟肿瘤细胞微环境中的智能响应性行为，为开发生理稳定性强、低毒、高效的氧化石墨烯纳米载体提供了一种简单有效的方法（图 1）。

图1 GO@PNIPAM NPs 合成示意图

1 实验

1.1 试剂与仪器

N–异丙基丙烯酰胺（NIPAM，A.R.级），东京化工有限公司；N,N’–双（丙烯酰）胱胺（BAC，纯度 98%）与二甲亚砜（DMSO，A.R.级），Sigma 公司；氧化石墨烯（GO，纯度98%），苏州恒球科技公司；十二烷基硫酸钠（SDS，C.R.级）、过硫酸钾（KPS）、亚硫酸氢钠（NaHSO3，纯度 98%），国药集团化学试剂有限公司；谷胱甘肽（GSH，B.R.级），Amresco 公司。NIPAM 以正己烷为溶剂进行重结晶。KPS 以蒸馏水为溶剂进行室温下重结晶处理。除此之外，其他试剂均可直接使用，无须进一步纯化。

傅里叶变换红外光谱仪（FTIR，Spectrum one 型）、热失重分析仪（TGA，TG-DTA 型），美国Perkin-Elmer 公司；激光粒度分析仪（ZS90 型），英国Malvern 公司；场发射扫描电子显微镜（SEM，JSM7100F 型），日本电子株式会社；波长808nm 的近红外激光器，北京华源拓达激光技术有限公司；热成像仪，美国Apresys 公司。

1.2 实验过程

1.2.1 PNIPAM NPs、GO@PNIPAM NPs 的合成

纳米粒子制备：将3.26mL 0.5mg/mL 的GO水 溶 液 、0.0648mmol/L NIPAM、0.0016mmol/L BAC 及 0.0073mmol/L SDS 溶于 50mL 超纯水中，置于单口烧瓶中搅拌并加热，至溶质完全分散，向其中通入氮气，同时持续搅拌、加热，当升温至60℃时，加入0.0200mmol/L KPS 及0.0259 mmol/L NaHSO3，并于60℃下持续搅拌6h；产物纯化：将产物置于透析袋（分子量为8,000-12,000Da）中，并在室温下于超纯水中透析三天，除去未反应完的化学物质；冻干保存：将得到的GO@PNIPAM NPs 冷冻干燥，以备后续研究使用。不加入GO，采用上述方法，制备PNIPAM NPs。

1.2.2 光热转换评价

采用808nm、2W/cm2的近红外激光器与热成像仪测试样品的光热转换能力。将1mL 250μg/mL的 GO、PNIPAM NPs 与 GO@PNIPAM NPs 的水溶液分别置于离心管中（1mL 水为对照组），对不同样品均光照7min，并由热成像仪监测样品温度，绘制样品温度随照射时间的变化曲线。

2 结果与讨论

2.1 GO@PNIPAM NPs 的合成与表征

为提高含GO 材料的胶体稳定性，通过简单一锅法，在混合NIPAM 与GO 溶液时，单体NIPAM 插层入少量堆叠的GO 片层中，在交联剂与引发体系的存在下进行原位聚合、交联，促使GO 堆叠的片层剥离，形成二维纳米片，包裹在PNIPAM 基质中，最终制得球状GO@PNIPAM NPs，制备过程见图 1。图 2 给出了 GO、GO@PNIPAM NPs 及 PNIPAM NPs 的傅里叶变换红外光谱图。在GO@PNIPAM NPs 的光谱图中，1546 cm-1与 1384 cm-1处出现了 NIPAM 的氨基的伸缩振动特征峰。红外光谱结果表明成功合成了GO@PNIPAM NPs。同时，如图3 所示，通过热失重分析（TGA），得到了纳米材料中GO 的含量为0.073%。

图2 GO、GO@PNIPAM NPs 及 PNIPAM NPs 的傅里叶变换红外光谱图

图3 GO、GO@PNIPAM NPs 及 PNIPAM NPs 的热失重曲线图

为验证“合成过程中GO 堆叠的片层被剥离”这一假设，使用SEM 表征了GO@PNIPAM NPs 的结构和形态。如图5 所示，通过原位聚合后，纳米粒子呈现均匀分散的球状，且SEM 图片中无明显的GO 层状结构，SEM 显示的结果与一些同行论文中的图片契合[9]。样品经GSH 处理10min 后，如图5 所示，纳米粒子堆叠在一起并被雪纺状物质包裹。相比原GO（图4），释放出的GO 片层更薄、尺寸更小（图 6）。最初，GO 纳米片位于GO@PNIPAM NPs 内。在还原剂（GSH）的作用下，纳米粒子降解，释放出已被剥离的GO。

图4 37℃下，GO 水溶液（0.5mg/ml）的 SEM 图像

图5 37 ℃下，溶于超纯水中的GO@PNIPAM NPs 的SEM 图像

图6 37 ℃下，用 5 mM GSH 处理 10 分钟后GO@PNIPAM NPs 的 SEM 图像

2.2 GO@PNIPAM NPs 的智能响应行为

为探究GO@PNIPAM NPs 在肿瘤细胞微环境（高温、酸性）及近红外光照下的智能响应行为，探索其在癌症治疗领域中的应用潜能，进行了不同环境下的体外性能测试。图7 给出了相同浓度 GO、PNIPAM NPs 及 GO@PNIPAM NPs 的水溶液在不同温度下的水力半径，从图中可看出，温度变化时GO 的水力半径也发生无规律的变化，而 PNIPAM NPs 与 GO@PNIPAM NPs 的水力半径则随着温度的升高而降低，说明通过原位聚合得到的目标产物GO@PNIPAM NPs 已具备了PNIPAM NPs 的温度响应性。此外，将GO@PNIPAM NPs 溶于不同 pH 的生理缓冲（PBS）溶液中，测其Zeta 电位，结果如图8 所示。在中性环境中 （pH=7.4），GO@PNIPAM NPs 的Zeta 电 位 为 -28 mV， 在 酸 性 环 境 中 ，GO@PNIPAM NPs 的Zeta 电位增大，且酸性越强，Zeta 电位越大，当粒子处于肿瘤细胞的酸性微环境（pH=5.0）中时，其Zeta 电位最大，达到-8 mV，说明 GO@PNIPAM NPs 具备 pH 响应性，它在中性环境中的低电位使其可通过静电相互作用负载带正电的抗癌药物（如盐酸阿霉素），在酸性环境中的较高电位又将降低其与药物之间的作用力，使药物到肿瘤细胞后加速释放，GO@PNIPAM NPs 在高温与酸性环境下的智能响应行为切合肿瘤细胞的微环境，展现出其在药物靶向递送中的较大潜能。

图7 不同温度下，0.5mg/mL 的GO、PNIPAM NPs 及GO@PNIPAM NPs 溶液的水力半径图

图8 37 ℃，不同 pH 下 0.5 mg/mL GO、PNIPAM NPs及GO@PNIPAM NPs 的水PBS 溶液的Zeta 电位图

除温度与pH 响应性外，GO@PNIPAM NPs也具备近红外光响应性。为探究GO@PNIPAM NPs 的光刺激响应性及其在光热疗法中的潜力，将GO@PNIPAM NPs 的水溶液（GO 的浓度为250μg/mL）在波长 808nm、功率密度 2W/cm2的近红外激光下照射7min。样品温度的变化由热像仪在实验期间测定并成像。如图9 所示，在光热转换实验过程中，GO@PNIPAM NPs 水溶液的温度升高了近50℃，而在相同的激光照射条件下，对照组超纯水的温度仅升高了2℃左右，GO水溶液的温度也仅上升了35℃左右。同时，随着GO 含量的增大，相同近红外光照射时，GO@PNIPAM NPs 水溶液的温度上升越快，说明GO@PNIPAM NPs 具有显著的光热效应（图10）。此外，如图7 所示，GO@PNIPAM NPs 具备温度响应性，因此，在近红外激光照射下，GO@PNIPAM NPs 将进行光热转化，使环境温度提高，既发挥热疗作用，也使材料的温度响应性更加明显，光热效应可通过远程操作，更易控制。

图9 GO 浓度为 250 μg/mL 的 GO、GO@PNIPAM NPs及PNIPAM NPs 水溶液的光热转换曲线图

图10 不同 GO 浓度（2.5 ～ 200 μg/mL）的GO@PNIPAM NPs 水溶液的光热转换效率图

3 结语

通过单体插层和原位乳液聚合制备了一种具有光热效应、生物相容性好的新型温度/pH/光热多重响应的纳米药物载体GO@PNIPAM NPs。实验结果表明：37℃、pH=7.4 下，GO@PNIPAM NPs 的尺寸在 73nm 左右，Zeta 电位为 28.1 mV。GO@PNIPAM NPs 呈规则球形，且还原环境中可降解。体外性能测试结果表明GO@PNIPAM NPs的水力半径随环境温度的升高而减小、Zeta 电位随环境酸性增强而增大，在模拟肿瘤的微环境中展现出迅速的智能响应性行为。同时在808nm、2W/cm2的近红外激光刺激下，GO@PNIPAM NPs的光热转换能力强、光热转换效率高，展现出其在药物靶向递送及光热疗法中的应用潜能。