罗格列酮干预对HSC-T6细胞增殖及细胞PPARγ和HO-1 mRNA水平的影响*

时扣荣，顾伟鹰，刘 娟，罗 兰，翟巧利，范 伟

肝纤维化是各种慢性肝病发展成为肝硬化的必经病理学过程，主要是由于肝星状细胞(HSCs)的过度增殖和活化造成细胞外基质(ECM)过度沉积[1]。研究证据[2,3]表明，肝纤维化过程是可以逆转的，抑制HSCs增殖或诱导其凋亡是阻止肝纤维化发展的潜在的治疗策略。多条信号通路参与了肝纤维化的发生过程，其中最经典的为转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号通路，后者可促使HSCs转化为肌成纤维细胞，合成ECM，导致肝纤维化，而HSCs又可释放大量的TGF-β1，促进ECM的合成，加速推动肝纤维化进展[4]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliforator-activated receptor-γ，PPAR-γ)是TGF-β信号通路中的重要细胞因子。研究[5]指出，PPAR-γ可抑制TGF-β1信号通路，从而抑制ECM的合成，延缓肝纤维化的发生。血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)是PPAR-γ的目的基因，其转录受PPAR-γ的调控[6]。罗格列酮(rosiglitazone，RGZ)属于PPAR-γ激动剂，可抑制HSCs的增殖和迁移，有效抑制肝纤维化的发生和发展[7]，但罗格列酮的作用机制尚不清楚。本研究分析了罗格列酮干预对HSC-T6细胞增殖及细胞PPARγ和HO-1 mRNA水平的影响，旨在为深入阐明罗格列酮抑制肝纤维化发生的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 大鼠HSC-T6细胞购自上海钰博生物科技有限公司，本实验室自行保存、传代培养，备用。罗格列酮购自上海皓元生物医药科技有限公司(取RGZ 0.5 mg，溶于二甲基亚砜溶液100μL，配制成5 mg/mL的储存液，保存于-80℃备用。使用时，用10%胎牛血清稀释成15μmol/L工作液)；DMEM培养基、10%优质胎牛血清购自美国Gibco公司；0.25%胰蛋白酶购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂盒购自广州杰特伟生物公司；AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒购自中国天根生物有限公司；cDNA反转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京碧云天生物技术研究所；兔抗鼠α-肌动蛋白(α-smooth muscleactin，α-SMA)、抗Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ，COLⅠ)、抗Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ，COLⅢ)和抗TGF-β1单克隆抗体购自英国Abcam公司；抗β-actin单克隆抗体购自沈阳万类生物科技有限公司；辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；离心机购自上海天本公司；实时荧光定量PCR扩增仪购自美国Thermo公司。

1.2 细胞培养与处理 取适量的HSC-T6细胞，接种于10 cm培养皿，培养液为DMEM培养基(含有10%优质胎牛血清)，培养条件为37℃、5% CO2的加湿培养箱，48 h换液一次。72 h传代一次。当细胞生长状态良好时，进行后续相关实验。将细胞分为对照组、RGZ处理组和RGZ联合HO-1抑制剂ZnPP-IX处理组。在对照组，不予任何处理，在实验组，分别给予15μmol/L RGZ干预或RGZ联合10μmol/L ZnPP-IX干预。

1.3 HSC-T6细胞增殖检测 采用MTT法，取对数生长期的HSC-T6细胞，用0.25%胰蛋白酶1 mL消化，制备成细胞悬液，调整细胞数为1×104个/mL。取100 μL细胞悬液，接种于96孔板，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养24 h。当细胞贴壁生长至融合度为 50%后，换用无血清培养基继续培养12 h，按以上要求分别加入RGZ或/和ZnPP-IX干预，每组设置8个复孔，继续培养72 h。每孔加入MTT(5 mg/mL)溶液20μL，再继续培养4 h，终止培养。每孔加入二甲基亚砜溶液150 μL，震荡混匀10 min，于酶标仪490 nm处检测各孔吸光度(absorbance，A)值，计算细胞生长抑制率，即细胞生长抑制率=[对照组A值-实验组A值]/对照组A值×100%

1.4 细胞凋亡检测 使用流式细胞仪检测，细胞处理同上，培养72 h后收集细胞上清，采用不含EDTA的胰蛋白酶消化，1000 r/m离心5 min，各组分别取1 ml加入2 mL离心管中，离心、混匀，并取PI 5μL和AnnexinV-FITC 10μL，充分混匀，置于室温下避光孵育15 min，上流式细胞仪检测，并应用Cell Quest软件计算各组细胞凋亡率。

1.5 细胞PPARγ和HO-1 mRNA水平检测 采用RT-PCR法检测，细胞分组和处理同上。采用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，使用分光光度计在260 nm和280 nm处测定RNA纯度和浓度。使用cDNA反转录试剂盒合成cDNA，再根据SYBR Green PCR Master Mix说明书进行RT-PCR检测，引物见表1，以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算细胞PPARγ和HO-1 mRNA水平。

1.6 细胞纤维化因子蛋白表达检测 采用Western Blot法，细胞处理同上，收集细胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取蛋白样品行SDS-PAGE凝胶电泳，再电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加5%脱脂奶粉封闭1.5 h，用TBST清洗3次。分别加入一抗(工作浓度 均为1：1000)，4℃孵育过夜，用TBST清洗，加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(工作浓度为 1：5000)，室温孵育1 h，用TBST再次清洗。以β-actin为内参蛋白，采用ECL化学发光试剂盒显影，在BIO-RAD 成像仪拍照，应用Image J 18.0软件分析目的条带灰度值，即目的蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

表1 RT-PCR引物序列

2 结果

2.1各组HSC-T6细胞增殖率比较 本研究对照组A值为(1.0±0.1)，RGZ干预组为(0.6±0.1)，较对照组细胞增殖活性降低了38.4%(P<0.05)，而RGZ联合ZnPP-IX处理组为(0.8±0.1)，较对照组降低了17.2%(P<0.05)，较RGZ组显著升高(P<0.05)，提示RGZ干预可显著抑制HSC-T6细胞增殖，而加入ZnPP-IX干预却能够显著削弱这种抑制作用。

2.2 各组HSC-T6细胞凋亡率比较 RGZ干预组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)，RGZ联合ZnPP-IX组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)，但显著低于RGZ组(P<0.05，图1)。

2.3 各组HSC-T6细胞PPARγ和HO-1 mRNA水平比较 RGZ处理细胞PPARγ和HO-1 mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)，而RGZ联合ZnPP-IX处理细胞 HO-1 mRNA水平显著低于RGZ组(P<0.05，表2)。

图1 各组HSC-T6细胞凋亡率比较A～C：流式细胞仪检测HSC-T6细胞凋亡；D：RGZ组细胞凋亡率显著高于对照组(①P<0.05)，RGZ联合ZnPP-IX组细胞凋亡率显著高于对照组(①P<0.05)，但显著低于RGZ组(②P<0.05)

表2 各组HSC-T6细胞PPARγ和HO-1 mRNA水平比较

2.4 各组HSC-T6细胞纤维化因子相关蛋白表达比较 RGZ处理细胞α-SMA、COLⅠ、COLⅢ和TGF-β1蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)，而RGZ联合ZnPP-IX处理细胞 α-SMA、COLⅠ、COLⅢ和TGF-β1蛋白表达显著高于RGZ组(P<0.05，图2)。

图2 各组HSC-T6细胞相关蛋白表达比较 A：对照组；B：RGZ处理组；C：RGZ联合ZnPP-IX处理组

3 讨论

PPARγ是一种配体激活的转录因子，可调节正常细胞和癌细胞的生长和分化[8-12]。PPARγ在肝脏内主要表达于星状细胞(HSCs)，但在活化的HSCs和肌成纤维细胞中缺乏表达[13]。研究[14]指出，PPARγ信号通路的激活能够抑制HSCs的活化，延缓肝纤维化进展，PPARγ有可能作为治疗肝纤维化的一种新的药物作用的靶点。RGZ为胰岛素增敏剂，亦为PPARγ的有效激动剂，近年来其抗纤维化作用越来越受到关注。RGZ能够与PPARγ发生特异性结合，进而抑制TGF-β信号通路，减少炎性细胞因子的分泌、释放，最终发挥抗纤维化作用[15]。为进一步探讨RGZ的抗纤维化作用，本研究采用RGZ干预HSC-T6细胞，结果表明RGZ可显著抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡。同时，RGZ干预还可显著降低纤维化因子α-SMA、COLⅠ、COLⅢ和TGF-β1蛋白表达，这些结果均提示RGZ具有抑制细胞增殖、诱导凋亡和抗纤维化的作用。

HO-1是一种限速酶，可催化血红素转化为胆绿素、一氧化碳和游离铁，具有很强的抗氧化、抗炎和调节细胞凋亡的作用[16]。HO-1又被称为热休克蛋白32，是一种HO同工酶，其在正常肝脏中表达于枯否细胞，处于应激状态时肝脏实质细胞和非实质细胞HO-1均呈现高表达[17]。报道[18,19]表明，HO-1在肝脏缺血再灌注损伤、急性肝脏损伤、脂肪性和酒精性肝病等疾病中均可发挥一定的肝细胞保护作用，是一种有应用前景的肝脏疾病治疗靶点。因此，在各种慢性肝病患者，诱导HO-1产生可能对于预防肝纤维化的发生具有重要的意义。HO-1与PPARγ之间存在协同调节作用。一项血管内皮细胞HO-1与PPARγ相互作用的研究[20]表明，HO-1酶活性可介导PPARγ配体的抗炎和抗增殖作用，且HO-1启动子区基因多态性显著影响了PPARα和PPARγ的转录活性。既往研究[21]也显示，HO-1可能通过增加肝组织PPARγ的表达来预防肝纤维化。本研究结果表明，经RGZ干预的HSC-T6细胞PPARγ和HO-1 mRNA水平均显著升高，而在加入HO-1抑制剂ZnPP-IX干预后，HSC-T6细胞HO-1 mRNA水平显著降低，同时HSC-T6细胞增殖和纤维化相关因子的表达亦受到显著抑制，细胞凋亡显著增加。文献报道[22]也表明，RGZ可通过调控PPARγ和HO-1表达，抑制HSCs增殖，减少胶原蛋白分泌和释放。RGZ作为PPARγ的特异性和高效激动剂，可显著上调PPARγ mRNA水平，同时上调HO-1 mRNA水平，而ZnPP-IX是一种选择性的HO抑制剂，可通过阻断一氧化氮的产生和限制血红素向胆绿素转化而抑制HO活性，抑制HO-1 mRNA水平，PPARγ mRNA水平亦有一定幅度的降低，表明PPARγ和HO-1存在双向调控作用。以上结果提示RGZ干预上调PPARγ表达可能是通过调控HO-1表达来发挥抗炎、抗氧化应激和诱导细胞凋亡的作用，进而抑制HSC-T6细胞增殖和纤维化的形成。