小泛素样修饰物特异性蛋白酶3通过调节脂滴水平体外促进HepG2细胞丙型肝炎病毒复制

刘文竹，胡 欣，江 伟，左秀静，朱华军

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV) 是造成慢性肝病的重要病原微生物。HCV感染往往难以引发适当的固有免疫应答，因而导致约80%感染者转为慢性感染，其中部分患者继而发展为HCV 感染相关性肝硬化，甚至肝癌[1，2]。小泛素样修饰物(small ubiquitin-like modifier，SUMO)化修饰是一个高度动态的翻译后修饰过程，广泛参与细胞周期调节、基因表达、信号转导和维持基因组稳定等过程[3]。与此同时，SUMO特异性蛋白酶家族(SUMO-specific protease，SENP)的去SUMO化功能发挥动态调节作用，其中SENP3可通过解偶联SUMO2和SUMO3，促进癌细胞转移、细胞增殖或凋亡，并作为感染、缺氧等多种应激的传感器[4]。近年来，研究显示脂滴对于HCV的复制具有关键性作用，而SENP3是细胞内脂质代谢调节的重要分子，但SENP3在HCV复制过程中扮演的角色尚不明确[5]。本研究初步探究了SENP3对HepG2细胞脂滴水平和HCV复制的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 HepG2 细胞和感染性HCV 病毒颗粒( cell-culture-derived infectious HCV，HCVcc) 由安徽医科大学安徽病原生物学省级实验室保存。DMEM 基础细胞培养基、胎牛血清购自美国GIBCO 公司；Lipofectamine© RNAiMAX试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；油红O、棕榈酸和油酸购自美国Sigma公司；Trizol RNA提取试剂盒购自Takara公司；实时定量PCR试剂盒购自天根生化科技(北京) 有限公司；抗HCV核心蛋白单克隆抗体、抗SENP3蛋白单克隆抗体和抗GAPDH多克隆抗体购于Cell Signaling公司。HCV RNA、内参GAPDH qRT-PCR引物和SENP3-siRNA 寡核苷酸均由吉玛基因公司合成。HCV RNA引物序列：5′-CTGTCTTCACGCAGAAAGCG-3′，3′- TCGCAACCCAACGCTACTCG-5′；GAPDH引物序列：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，3′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-5′；SENP3-siRNA 寡核苷酸序列：5′-GGGCUGGAAAGGUUACUUCdTdT-3′，3′-dTdTCCCGACCUUUCCAAUGAAG-5′。

1.2 HCV感染HepG2细胞 取对数生长期的HepG2细胞，消化后以1×105个/孔的密度接种于24孔细胞培养板，采用添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和10 μg/ml链霉素的DMEM完全培养基，于37 ℃、饱和湿度、5% CO2条件下培养24 h。继而，按感染复数( multiplicity of infection，MOI)为0.5加入HCVcc，分别于细胞培养箱孵育0 d、3 d和6 d，弃去上清并以预冷的PBS洗涤细胞后采用Western blot 法检测HCV核心蛋白和SENP3蛋白表达量，每组细胞设3个复孔。

1.3 转染HepG2细胞 采用脂质体法，取HepG2细胞，以1×105个/孔接种于24孔板，培养过夜。将SENP3-siRNA或NS-siRNA以0.2 pmol/μL(终浓度)溶解于Opti-MEMR溶解液中，另按体积比3：50将LipofectamineRRNAiMAX溶于Opti-MEM©溶解液。将上述溶液等体积轻柔混匀后，室温孵育5 min，继而以每孔50 μL混合液加入24孔板，培养3 d。采用Western blot法检测SENP3蛋白表达水平。另取上述转染后的HepG2细胞，加入MOI为0.5的HCVcc，感染3 d，采用Western blot法检测HCV核心蛋白表达量，采用qRT-PCR法检测HCV RNA水平，采用油红O染色，观察细胞脂滴水平[6]。

1.4 细胞蛋白表达量检测 采用Western blot法，将上述预处理后的细胞弃去培养基，以预冷的PBS洗涤后加入细胞裂解液，充分吹打后将裂解物转移至EP管中，于冰上振荡30 min，置于低温高速离心机，15000 g离心15 min，转移上清并加入SDS-PAGE上样缓冲液、煮沸5 min。继而行SDS-PAGE 电泳，并电转移至PVDF膜。封闭后，根据蛋白分子量标记剪下目的条带，以GAPDH作为内参。分别加入兔抗HCV核心蛋白单克隆抗体( 1：1 000)、兔抗人SENP3单克隆抗体( 1：1 000)、抗GAPDH多克隆抗体( 1：2 000)，4℃孵育过夜。用TBST洗膜3次，加入HRP 标记的二抗( 1：5000)，室温孵育60 min，洗膜后以BCIP /NBT 碱性磷酸脂酶显色试剂盒显色，应用Image J 软件行灰度分析[7]。

1.5 细胞HCV RNA水平检测 采用qRT-PCR法，取待检测的细胞，严格按照产品说明书采用TRIzol 试剂盒提取总RNA，并采用SYBRGreen 法进行qPCR 扩增反应，以GAPDH 作为内参基因，反应条件为: 95 ℃ 15 s，55℃ 15 s, 68℃ 30 s。循环进行45 次，采用2-ΔΔCt法分析各处理组HCV RNA 水平[8]。

1.6 细胞回补软脂酸 将棕榈酸与油酸按1∶2混合，配置含软脂酸总浓度为0.5 mmol/L的DMEM完全培养基。弃去HepG2细胞原培养基，以上述含脂肪酸培养基于37 ℃、饱和湿度、5% CO2条件下培养12 h[9]。

1.7 细胞脂滴检测 用PBS洗涤细胞，采用40 g/L多聚甲醛溶液室温固定10 min，继而以5 g/L油红O在避光条件下染色60 min，用PBS洗涤细胞，以100 ng/ml DAPI染色10 min，用PBS洗涤后，在镜下观察细胞[9]。

2 结果

2.1 HCV感染HepG2细胞SENP3蛋白表达量上调 在HCV与HepG2细胞共孵育后的第一天、第三天和第六天，检测显示以GAPDH作为内参，HCV 核心蛋白相对表达量分别为0.01±0.00、0.17±0.02和0.43±0.04，SENP3蛋白相对表达量分别为0.23±0.04、0.42±0.03和0.46±0.04，两蛋白表达量进行性升高(P<0.05)，提示HCV有效感染HepG2细胞，并且病毒复制增强。与此同时，SENP3蛋白表达量也相应增强，提示在HepG2细胞，HCV感染促进了SENP3表达(图1)。

图1 HCV感染HepG2细胞SENP3蛋白表达A：HepG2细胞HCV 核心蛋白和SENP3蛋白表达；B：随感染时间延长，蛋白表达增强与第一天比， aP<0.01； 与第三天比，bP<0.05

2.2 敲低SENP3蛋白表达抑制HCV 复制 采用脂质体法转染SENP3-siRNA至HepG2细胞，以非特异性siRNA作为对照，经Western blot法检测显示SENP3蛋白表达水平显著降低，表明该方法可有效下调SENP3表达(图2A)；继而，以HCV感染SENP3敲低后的细胞，检测发现细胞HCV核心蛋白相对水平明显低于对照组(图2B)。以转染非特异性siRNA组细胞为参照，SENP3敲低组细胞HCV RNA水平为54.23±11.35 %，较转染非特异性siRNA组细胞显著降低(P<0.01，图2C)，初步表明SENP3蛋白促进HCV复制。

图2 敲低SENP3的HepG2细胞HCV复制变化A：转染SENP3-siRNA后，细胞SENP3蛋白表达水平下调；B：敲低SENP3细胞HCV 核心蛋白表达下调；C：敲低SENP3细胞HCV RNA水平下调与转染NS-siRNA比，aP<0.01

2.3 敲低SENP3蛋白表达后细胞脂滴水平变化 以油红O对转染后的HepG2细胞进行染色，在荧光倒置显微镜下观察可见转染非特异性siRNA的HepG2细胞质中散布较多的红色荧光斑点，而转染SENP3-siRNA的细胞中荧光斑点显著减少，见图3。

图3 敲低SENP3细胞脂滴变化 转染SENP3-siRNA细胞红色荧光斑点数显著少于转染NS-siRNA细胞(油红O/DAPI染色， 400×)

2.4 SENP3下调后回补软脂酸对HCV复制的影响 以转染非特异性siRNA组细胞为参照，经qRT-PCR法检测显示敲低SENP3的HepG2细胞HCV RNA相对水平为58.2±5.2%，较转染非特异性siRNA组细胞显著降低(P<0.01)，而以软脂酸处理SENP3敲低的HepG2细胞，HCV RNA相对水平为74.6±6.4%，较未经软脂酸处理组细胞显著升高(P<0.01，图4)。

图4 回补软脂酸对细胞HCV复制的影响与转染NS-siRNA比，aP<0.01，与转染SENP3-siRNA比，bP<0.01

3 讨论

脂滴是由单层两性磷脂包裹疏水核心构成，用于贮存胆固醇酯、三酰甘油等多种中性脂，并可转化游离脂肪酸以避免抑制脂肪酸积聚及其毒性衍生物的产生[10]。脂滴不仅参与调控脂质代谢、维持细胞内环境稳态，在细菌、病毒、寄生虫在内的多种病原体感染和免疫过程中亦发挥重要的相互作用[11,12]。HCV可通过“劫持”宿主的脂质进行增殖。HCV利用脂蛋白的组装和分泌进入内质网，在富含脂质的内质网膜室开始病毒衣壳的形成之前，HCV与脂滴相互作用[13]。以载脂蛋白E (apoE)为代表的交换性载脂蛋白在增强HCV特异性传染过程中发挥着关键作用[14]。与此同时，HCV病毒粒子可能与血管中循环的其他脂蛋白相互作用，并与载脂蛋白和脂质结合[15]。目前认为，在HCV感染的过程中，脂滴参与HCV复制、组装和病毒颗粒释放，影响HCV生活周期，并为HCV的能量储存器和脂质储库[16]。在HCV复制时，病毒可利用脂滴相关蛋白47 kD 尾连蛋白(tail-interacting protein 47 kD，TIP47)作为新型辅助因子，通过非结构蛋白5 (nonstructural protein 5，NS5A)蛋白与其相互作用，从而将脂滴膜整合至HCV复制所需膜网结构中[17]。此外，NS5A可与另一种脂滴相关蛋白Rab18结合进而将复制位点募集至脂滴上[18]。近年来的研究显示，SUMO特异性蛋白酶家族成员SENP3在脂质代谢过程中发挥重要的作用，参与非酒精性脂肪肝等脂质代谢相关疾病的发生和发展。然而，据我们所知，SENP3是否参与HCV感染过程，尚未见报道[19]。

在本研究中，我们发现HCV感染HepG2细胞可上调SENP3蛋白表达水平，而敲低SENP3则降低HCV感染后HCV核心蛋白表达和HCV RNA水平，而HepG2细胞脂滴水平也下降。这些结果初步表明在HCV感染过程中SENP3可促进HCV的复制并调节脂质代谢，提示HCV可能通过影响SENP3表达作为促进其复制的策略之一。基于脂滴可转化游离脂肪酸为中性脂并将其存储的功能，HepG2细胞与软脂酸共孵育可提高脂滴水平[20]。在敲低HepG2细胞SENP3蛋白表达水平后，采用软脂酸回补脂滴水平可有效降低SENP3蛋白表达下调对HCV复制的影响，表明SENP3可能通过调节脂滴代谢而促进细胞HCV复制。有趣的是，有研究显示在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染HepG2细胞时，SENP3可通过抑制肝细胞AKT磷酸化水平从而抑制HBV DNA载量，且HBV转基因小鼠肝组织SENP3表达显著降低[21]。在HepG2-NTCP细胞和人源化小鼠模型，感染HBV的肝细胞SENP3表达水平下降，下调SENP3可减少HBV复制并促进宿主蛋白翻译，这可能是肝细胞的宿主防御机制之一[22]。上述研究提示SENP3在不同噬肝病毒感染过程中可发挥差异性作用。

综上所述，本研究初步显示SENP3可作为新的宿主因子，通过调节脂滴水平促进HCV的复制，并可能为治疗HCV感染性疾病提供新的靶点。后续，我们将细化研究涉及该现象的信号通路，以进一步明确其分子调节机制。