抗环瓜氨酸肽抗体IgG检测试剂(酶联免疫吸附试验)的临床试验*

王思英，杨湘越

1.福建医科大学附属第一医院输血科，福建福州 350005；2.中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院检验科，福建福州 350001

类风湿关节炎(RA) 是一组以关节滑膜炎为主要表现的慢性全身性自身免疫性疾病，在任何年龄均可发病，发病率随着年龄增长呈现递增趋势。有研究显示RA的全球发病率约为1.0%，在我国为0.32%～0.36%，致残率高达15%[1-2]，RA患者与相同年龄、性别的健康人比较总死亡率增加[3]。国外较多研究证实，通过对RA患者血清抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体的检测，能够对RA患者进行早期病情诊断和预测，对治疗和预后监测均具有重要意义[4]。丝集蛋白中的稀有氨基酸瓜氨酸是抗CCP抗体主要的抗原表位，通过比较研究发现，用环化的瓜氨酸肽代替线性的瓜氨酸肽作为酶联免疫吸附试验(ELISA)的抗原基质，可将灵敏度从49%提高到68%，抗CCP抗体是RA的一个高度特异的新指标[5-8]。抗CCP抗体的出现独立于类风湿因子(RF)。彭吉芳[9]的研究表明，RF不仅存在于RA患者中，在其他疾病(如干燥综合征、麻风、细菌性心内膜炎等)中也被检出，甚至在健康人中也被检出。把RF阴性的患者称为“血清反应阴性的RA”的说法已经过时了，不应再使用。许多研究显示，20%～57% RF阴性的RA患者血清中存在抗CCP抗体。因此，平行检测这两种抗体有利于提高RA患者的血清学检出率[10-14]。目前批准上市的抗 CCP 抗体检测试剂很多，并且在临床得到了广泛使用，但大部分基层医院因成本等原因没有开展抗 CCP 抗体检测。为推广国产抗 CCP 抗体IgG检测试剂(ELISA)的应用，本研究以上海荣盛生物药业有限公司生产的抗CCP抗体检测试剂(ELISA，沪食药监械(准)字2013第2401823号)为对照试剂，以欧蒙(德国)医学实验诊断有限公司生产的抗CCP抗体IgG检测试剂(ELISA，国械注进20162400106)为第三方试剂，对欧蒙(杭州)医学实验诊断有限公司作为申请人申请的抗CCP抗体IgG检测试剂(ELISA，拟注册)进行临床验证，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 标本来自2019年1—9月中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院常规检测的剩余标本，在≤-20 ℃的低温条件下长期保存，所有标本的相关信息完整，试剂为欧蒙(杭州)医学实验诊断有限公司作为申请人申请的抗CCP抗体IgG检测试剂(ELISA，拟注册)。根据《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》要求，本试验所评价试剂属于二类体外诊断试剂，临床试验的总血清标本数至少为200例，同源血浆标本100例，分两家医院完成，中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院负责其中的116例有效血清标本及53例有效同源血浆标本。标本分为疾病组(来自临床怀疑为抗CCP抗体阳性的患者)血清67例、血浆15例，易混组(来自已明确为其他疾病且未送检抗CCP抗体的患者)血清19例、血浆8例，对照组(健康人群)血清30例、血浆30例。本试验经中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院伦理委员会批准。

1.2方法 待评价试剂用于体外半定量或定量检测人血清或血浆中抗CCP IgG型抗体，适应证为RA。本试验采用对照试验和双盲法设计，将同一标本用待评价试剂、对照试剂及第三方分别进行检测。将待评价试剂检测结果与对照试剂及第三方试剂检测结果进行比较，评价待评价试剂与对照试剂及第三方试剂试剂检测结果的一致性和相关性。采用待评价试剂对同一人的血清和血浆标本分别进行检测，判断待评价试剂对血清和血浆标本检测结果的一致性和相关性。试剂中每个微孔板条含有8个可拆分的包被有合成CCP的微孔。在第1次温育时，稀释后的标本(血清或肝素、EDTA、柠檬酸抗凝的血浆)在微孔中反应。如果标本阳性，特异性的IgG(包括IgA和IgM)与抗原结合，为了检测结合的抗体，加入酶标抗人IgG抗体(酶结合物)进行第2次温育，以发生颜色反应。

1.3统计学处理 两种诊断试验的一致性比较采用定性检测，以符合率和Kappa值进行评价。Kappa值:≥0.75为一致性好；0.40～<0.75为一致性一般； <0.40为一致性较差。相关性分析采用回归分析，将待评价试剂检测结果(Y)分别和对应的对照试剂及第三方试剂检测结果(X)作回归分析布图，建立回归方程Y=a+bX并分析。R>0.9时,所得到的回归直线拟合得较好；R<0.5时，所得到的回归直线很难说明变量之间的依赖关系。

2 结 果

2.1待评价试剂与对照试剂一致性及相关性分析

2.1.1待评价试剂与对照试剂一致性分析 一致性分析结果显示，阳性符合率为70.00%(21/30×100%)，阴性符合率为95.35%(82/86×100%)，总符合率为88.79%(103/116×100%)，kappa值为0.69。见表1。

表1 待评价试剂与对照试剂一致性分析结果(n)

2.1.2待评价试剂与对照试剂相关性分析 最终共有20份标本的检测结果在待评价试剂与对照试剂检测范围内，对这20份血清标本的结果进行了回归分析，回归方程：Y=1.629X+0.968 9，R=0.51。见图1。

图1 待评价试剂与对照试剂相关性回归分析图

2.2待评价试剂与第三方试剂一致性及相关性分析

2.2.1待评价试剂与第三方试剂一致性分析 一致性分析结果显示，阳性符合率为73.53%(25/34×100%)，阴性符合率为100.00%(82/82×100%)，总符合率为92.24%(107/116×100%)，kappa值为0.80。见表2。

表2 待评价试剂与第三方试剂一致性分析结果(n)

2.2.2待评价试剂与第三方试剂相关性分析 最终共有26份标本的检测结果在待评价试剂与第三方试剂检测范围内，对于这26份血清标本的结果进行了回归分析，回归方程：Y=0.948 5X-4.640 2，R=0.97。见图2。

图2 待评价试剂与第三方试剂回归分析图

2.3待评价试剂与对照试剂/第三方试剂检测结果综合比较 待评价试剂与对照试剂的检测结果不符的情况下，采用第三方试剂的结果为准，再次进行了所有结果的综合，与待评价试剂进行对比，结果显示，阳性符合率为89.29%(25/28×100%)，阴性符合率为100.00%(88/88×100%)，总符合率为97.41%(113/116×100%)，kappa值为0.93。见表3。

表3 待评价试剂与对照试剂和第三方试剂检测结果综合比较(n)

2.4待评价试剂血清与同源血浆标本检测结果一致性及相关性分析

2.4.1待评价试剂血清与同源血浆标本检测结果一致性分析 总共53份与血清标本同源的血浆标本采用待评价试剂进行了检测，一致性分析结果显示，阳性符合率为81.82%(9/11×100%)，阴性符合率为95.24%(40/42×100%)，总符合率为92.45%(49/53×100%)，Kappa值=0.77。见表4。

表4 待评价试剂血清与同源血浆标本检测结果比较(n)

2.4.2待评价试剂血清与同源血浆标本检测结果相关性分析 对同源血清与同源血浆的定量检测结果进行了分析，最终共有10份标本的检测结果在待评价试剂与第三方试剂检测范围内，对于这10份血清和血浆标本的结果进行了回归分析，回归方程：Y= 0.835X+15.886,R=0.92。见图3。

图3 待评价试剂血清与同源血浆标本检测结果回归分析图

3 讨 论

RA是一类病因未明、以慢性持续性关节破坏为主要临床表现的系统性自身免疫性疾病，关节受累为其主要而非唯一的临床表现[15]。近年来有研究发现，抗CCP 抗体阳性的RA 患者更易出现严重的关节破坏，且抗CCP 抗体滴度与RA 的病情活动度相关，因而也可作为评判病情及预后的重要指标[16-17]。有研究显示[18-19]，女性发病率为男性的2～3倍，在GADEHOLT等[20]的研究结果中，抗CCP抗体阳性患者的病程较抗CCP抗体阴性患者长，可能与抗CCP抗体阳性患者的发病更早相关。因此为使疾病能够得到尽早发现、尽早治疗，早期筛查显得格外重要。抗CCP抗体检测试剂大量应用于RA患者、健康者，此外，基层医院的筛查费用较昂贵(尤其使用进口试剂时)，因此推广国产试剂有利于降低成本费用，这也是本临床试验的意义所在。

待评价试剂用于体外半定量或定量检测人血清或血浆中抗CCP IgG型抗体。本临床试验采用了待评价试剂与对照试剂/第三方试剂比较的方法确认了待评价试剂的性能,同时本临床试验增加了待评价试剂与第三方试剂的性能对比作为性能评价的补充评价标准。考虑到目前市场上占有率最高的同类产品为欧蒙(德国)医学实验诊断有限公司生产的抗CCP抗体IgG测定试剂(ELISA)，有必要将待评价试剂的性能与目前最广泛使用的产品进行性能比较，因此本临床试验选择欧蒙(德国)医学实验诊断有限公司生产的产品作为第三方试剂，并且采用第三方试剂对所有待检测标本进行检测。在116例有效检测血清标本中，待评价试剂与对照试剂间共出现13例不一致结果，经过第三方试剂检测，待评价试剂与对照试剂/第三方试剂间共出现3例不一致结果。这3例血清标本采用待评价试剂与第三方试剂检测，结果均在临界值左右，第三方试剂检测结果为弱阳性而待评价试剂检测结果为阴性。因此该3例标本的检测结果不能说明待评价试剂与第三方试剂检测性能存在重大差异。

本临床试验单位共检测有效血清标本116例，有效同源血浆标本53例。待评价试剂与对照试剂的血清检测结果阳性符合率为70.00%，阴性符合率为95.35%，总符合率为88.79%，kappa值为0.69。针对定量结果进行分析，回归方程：Y=1.629X+0.968 9，R=0.51。表明待评价试剂与对照试剂血清标本检测结果一致性良好，但是相关性不佳。待评价试剂与第三方试剂的血清检测结果阳性符合率为73.53%，阴性符合率为100.00%，总符合率为92.24%，kappa值为0.80。针对定量结果进行分析，回归方程：Y=0.948 5X-4.640 2，R=0.97，表明待评价试剂与对照试剂血清标本检测结果一致性和相关性良好。待评价试剂与对照试剂检测不相符的标本，以第三方试剂的而检测结果为准，最终待评价试剂与对照试剂/第三方试剂的血清检测阳性符合率为89.29%，阴性符合率为100.00%，总符合率为97.41%，kappa值为0.93。表明待评价试剂与对照试剂/第三方试剂血清检测结果一致性良好。待评价试剂检测血清与同源血浆标本阳性符合率为81.82%，阴性符合率为95.24%，总符合率为92.45%，kappa值为0.77。针对定量结果进行分析，回归方程：Y=0.835X+15.886，R=0.92。表明待评价试剂检测血清与同源血浆标本的符合性和相关性良好。

综上所述，本试验中的待评价试剂与对照试剂/第三方试剂的检测结果有良好的一致性和相关性，待评价试剂检测血清与同源血浆标本的一致性及相关性均良好，提示有较好的临床适用性。