贵州主栽樱桃品种的植原体分子检测及鉴定

田文杰， 乔 光， 文晓鹏， 田 田， 洪 怡

(贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院，山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室，山地生态与农业生物工程协同创新中心， 贵阳 550025)

樱桃(CerasuspseudocerasusLindl.)是蔷薇科、李属、樱亚属植物，成熟期早，营养丰富，经济、社会价值高[1]。樱桃是贵州省精品水果产业之一，在贵州省西北部、中部和北部广泛种植，根据贵州省农业农村厅统计，在“十三五”期间，贵州省樱桃种植面积达3.33万hm2，主要以玛瑙红、黑珍珠等中国樱桃为主，在全省脱贫攻坚和乡村振兴上发挥了重要作用。

植原体(phytoplasma)又称为类菌原体(mycoplasma-likeorganism，MLO)，是一种由细胞膜包裹、没有细胞壁、不能够人工培养、寄存于植物韧皮部及刺吸式介体昆虫的肠道、淋巴、唾腺等组织内的单细胞原核生物[2]。世界各地已报道植原体可引起1 000余种植物的系统性病害，危害多种果树、蔬菜、花卉和林木等[3]。樱桃植原体病害主要包括樱桃黄化致死病[4]、樱桃衰退病[5]、樱桃花变绿或叶病[6-7]、樱桃X病[8]、樱桃丛枝病[9]，严重影响樱桃的生产和产业的发展。2018年以来，在桐梓县、大方县、修文县、贵阳市乌当区等地陆续发现大面积自然花变叶、丛枝等疑似植原体感染的樱桃植株，万艳等[10]报道贵州省毕节市樱桃发生花变叶、花变绿、丛枝等植原体侵染的现象，严重影响樱桃产量。

植原体传播快，危害大，尚无有效的化学防治手段，因此建立植原体检测技术对植原体病害的防控具有重要意义。早期植原体检测主要是根据植株感病所表现的特有症状、组织切片观察或通过喷洒、注射植原体敏感的抗生素[11-12]，但这些方法费时费力，结果的可信度低。随着技术的进步，电子显微镜法、组织化学法、血清学方法、PCR法和核酸杂交法等大大提高了检测效率，目前，PCR检测方法是应用最为广泛的植原体检测方法，此方法灵敏度高、且能快捷简便地检测植物病原。

20世纪80年代，Woese等[13]提出了利用16 S rDNA保守基因序列作为植原体分类的方法，随之更多的学者基于16 S rDNA基因序列对植原体进行分类。16 S rDNA序列是原核生物染色体基因组上进化过程中高度保守的一段rDNA编码区序列，目前，植原体的物种命名主要基于16 S rDNA序列在植原体中的差异性[14]，通过植原体的通用引物和特异性引物扩增出的16 S rDNA序列，是植原体鉴定、分类、划分组和亚组的主要参考依据。

本研究优化了适合贵州樱桃的巢式PCR植原体检测体系，同时对贵州省7个主要樱桃产区的86份样品进行植原体分子检测，对获得的植原体16 S rDNA序列进行亲缘关系分析，明确病原菌的分布及分类地位，旨在为贵州省樱桃植原体病害防控提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

2020年6—8月在贵州省福泉市、六枝特区、大方县、纳雍县等地采集86个樱桃植株的叶片，液氮速冻后带回实验室，存放于-80 ℃冰箱备用。

1.2 樱桃叶片总DNA的提取

采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(DP 320-02，天根生化科技有限公司)提取86份樱桃叶片的总DNA，利用全波长酶标仪(Thermo Scientific USA)和1%琼脂凝胶电泳检测总DNA样品浓度和纯度，合格的总DNA立即存放于-20 ℃冰箱，备用。

1.3 植原体的巢氏PCR分子检测

1.3.1引物选择及合成

采用植原体16 S rDNA序列的通用引物对R 16 mF 2/R 16 mR 2和R 16 F 2 n/R 16 R 2[14-15]，引物经上海生工生物工程公司合成。引物序列具体如下：

表1 植原体 16 S rDNA 基因序列的通用引物对

1.3.2PCR反应体系及程序的优化

利用提取的DNA为模版，外侧引物对R 16 mF 2/R 16 mR 2为引物进行PCR反应体系及程序优化，根据文献报道及预实验结果，设置初始PCR反应体系为：反应模板1.0 μL，10×PCR缓冲液2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL，5 U/μLTapDNA 聚合酶0.25 μL，10 μmol/L正反引物各1.0 μL，添加ddH2O至体系为20 μL。初始PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。对PCR反应体系中的以下各项条件进行单因素逐步优化：

1) 2.5 mmol/L dNTP用量设置8个梯度，分别为：0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.2 μL、1.4 μL、1.6 μL、1.8 μL；

2) 5 U/μLTaqDNA聚合酶用量设置8个梯度，分别为：0.1 μL、0.15 μL、0.2 μL、0.25 μL、0.3 μL、0.35 μL、0.4 μL、0.45 μL；

3) 10 μmol/L引物的用量设置9个梯度，分别为：0.1 μL、0.3 μL、0.5 μL、0.7 μL、0.9 μL、1.1 μL、1.3 μL、1.5 μL、1.7 μL；

4) 反应条件退火温度设置10个梯度，分别为：48 ℃、50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃、64 ℃、66 ℃，每个条件重复3次，取10 μL扩增产物用于1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3巢氏PCR检测

以提取总DNA作为模板，玛瑙红樱桃组培苗DNA作为阴性对照，利用外侧引物对R 16 mF 2/R 16 mR 2进行第一次PCR扩增，以第一次PCR扩增出的产物稀释10倍为模板，内侧引物对R 16 F 2 n/R 16 R 2为引物进行第二次PCR扩增，两次PCR反应体系及程序均采用优化后的PCR反应体系及程序。

1.4 目的序列的克隆、测序及分析

利用DNA凝胶回收试剂盒(TDP 209-02，天根生化科技有限公司)将PCR扩增产物进行回收纯化后，把产物连接至pEASY-Blunt cloning载体上，再将连接产物转化到大肠杆菌DH 5 ɑ(北京全式金生物技术有限公司)感受态细胞中，涂布在含有卡那霉素(Kanamycin，Kan)的LB培养基平板上，37 ℃过夜培养，挑取PCR检测含有目标条带的阳性克隆菌样，送上海生工生物工程公司测序。将获得序列在NCBI数据库进行BLAST比对，利用 DNAMAN软件进行同源性分析，通过MEGAX 64软件构建系统进化树；利用 iPhyClassifier在线工具对获得的16 S rDNA序列进行虚拟的RFLP分析。

2 结果与分析

2.1 PCR反应体系及程序优化

优化后PCR的反应体系为：反应模板1.0 μL，10×PCR缓冲液2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.0 μL，5 U/μLTapDNA聚合酶0.2 μL，10 μmol/L正反引物各0.5 μL，添加ddH2O至体系为20 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性 40 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。

2.1.1dNTP浓度对PCR反应的影响

从图1可知，dNTP的浓度较低时，PCR扩增的效果不理想，随着浓度增加，条带逐渐明亮，但浓度过高也会抑制反应，其中以在泳道3和泳道4中扩增出的条带清晰明亮。由此，本实验选择2.5 mM dNTP的用量为1.0 μL。

注:M为DNA分子量标准 DL 2 000,下同；1～8为dNTP用量(0.4～1.8 μL，按0.2 μL递增)。

2.1.2TaqDNA聚合酶浓度对PCR反应的影响

如图2所示，随着TaqDNA聚合酶浓度的增加，扩增出的条带逐渐变得清晰明亮，泳道3～9条带都较清晰，本实验选择5 U/μLTaqDNA聚合酶用量为0.2 μL。

注:1～9为TaqDNA 聚合酶用量(0.1～0.5 μL，按0.05 μL递增)。

2.1.3引物浓度对PCR反应的影响

结果如图3所示，除了在泳道1中未扩增出条带外，从第2泳道开始均有目的条带的出现,泳道3条带明亮清晰，本实验选择引物用量(10 μmol/L)为0.5 μL。

注:1～9为引物用量(0.1～1.7 μL，按0.2 μL递增)。

2.1.4退火温度对PCR反应的影响

从图4可知，温度在48 ℃至62 ℃均有目标条带的扩增，当温度达到64 ℃以上时，没有目标产物的扩增，而在58 ℃时扩增出的条带清晰明亮，且无非特异性条带扩增，因此本实验最佳温度选择58 ℃。

注:1～10为退火温度(48～66 ℃，按2 ℃递增)。

2.2 田间样品检测结果

利用优化的巢式PCR方法对贵州省不同地方的86份样品进行分子检测，在86份樱桃样品中有52份扩增出约1.2 kb的特异性条带(图5)，如表2所示，除了六枝的样品未检测到植原体外，其他采样点的样品均呈阳性，其中纳雍县、福泉市、贵阳市乌当区样品检出率高达100%，威宁县、沿河县、大方县分别为40.74%、66.67%和40.00%。

表2 贵州樱桃植原体分子检测结果

注:1～16为纳雍样品；17为健康组培苗。

2.3 16 S rDNA序列的测定及同源性分析

将PCR扩增出来的特异条带进行回收、克隆、测序。分别获得长度为1 251 bp及1 255 bp的扩增片段，分别命名为GZ-1，GZ-2。在NCBI上进行同源性比较，结果(表3)表明，GZ-1、GZ-2植原体序列与榆树黄化植原体组(Elm yellows，16 Sr V)同源性均在 97.93% 以上，与其他组植原体同源性介于88.16%～94.97%之间，相对较低，说明所得序列属于植原体16 Sr-V组。GZ-1植原体序列与16 Sr V-B组的甜樱桃花变绿植原体(登录号：MF 848961)和枣疯病植原体分离物(登录号：AB 052876)同源性分别达到99.36%和99.43%；GZ-2同16 Sr V-B组的中国樱桃花变叶(登录号：JN 607240)和枣疯病植原体分离物(登录号：AB 052876)同源性分别为99.20%、99.27%，表明获得的植原体序列与植原体16 Sr V-B亚组同源性最高。

表3 贵州樱桃植原体同16 Sr各组植原体16 S rRNA基因片段的核苷酸序列比较

2.4 系统进化树分析

将本研究获得的GZ-1、GZ-2植原体序列与已报道的22条不同组的植原体序列进行比较，通过MEGAX 64软件构建进化树(图6)。从构建的系统进化树可知，获得的序列与桃树黄化病、枣疯病等16 Sr V组的植原体划分在同一分枝上，与同源性分析结果相一致，表明GZ-1、GZ-2植原体序列属于16 Sr V组。GZ-1植原体序列同16 Sr V-B亚组的枣疯病、甜樱桃花变绿、樱桃花变叶病聚为一枝，说明GZ-1序列应当属于16 Sr V-B亚组；而GZ-1与16 Sr V各亚组均未聚到同一枝上，形成独立的一枝，表明GZ-2植原体有可能为新的亚组。

图6 基于植原体16 S rDNA基因核苷酸序列的系统进化树

表4 贵州樱桃植原体及16 Sr V组的各亚组植原体株系的相似系数分析

2.5 虚拟RFLP分析

利用植原体的分类鉴定iPhyClassifier在线软件对获得的GZ-1、GZ-2的序列进行虚拟RFLP分析及相似系数分析，结果显示，GZ-1序列与16 Sr V-B亚组中代表株系枣疯病植原体(登录号:AB 052876)、甜樱桃花变绿(登录号:MF 848961)樱桃花变叶(登录号:JN 607240)相似系数分别为1.00，1.00、0.98，且GZ-1序列的在线酶切图谱与枣疯病植原体图谱结果完全相同(见图7)，确定GZ-1序列属于16 Sr V-B亚组；GZ-2的在线酶切图谱不同于16 Sr V组的任何亚组，与16 Sr V-B亚组相似系数最高为 0.97(F≤0.97)。依据 Wei等[13]对植原体亚组划分的规定，建议将GZ-2植原体命名为新的亚组。

注：A为GZ-1模拟16 S rRNA-RFLP酶切图；B为GZ-2 模拟16 S rRNA-RFLP酶切图；C为枣疯病植原体模拟酶切图。

3 讨 论

植原体已经成为严重危害樱桃产业的病害之一，该病害可通过多种昆虫介体进行传播，传播范围广泛，目前未见非常有效的治疗手段，所以建立一套植原体检测方法，用以开展早期病害调查、检测，及时铲除病树病枝，加强苗木调运的检疫，对防止病害流行十分必要。玛瑙红樱桃因其甜度高，耐储运等特点，是目前唯一走出贵州省并远销北上广等经济发达地区的品种，在珠三角地区深受消费者喜爱，具有了一定的品牌知名度，近几年来，种植面积迅速增加，但目前基本都采用高枝压条育苗方式，苗木流通也比较粗放，没有严格的检疫检验流程，这也会增加植原体传播的风险。本研究优化了樱桃植原体16 S rDNA巢氏PCR检测方法，检测灵敏度高、结果稳定可靠，同时利用此优化的检测方法对贵州省7个樱桃主产区的玛瑙红及黑珍珠樱桃进行检测，在6个产区内都检测出植原体，这表明植原体病害在贵州省已普遍存在，开展相应的植原体病害防控已经十分紧迫，如加强离多发地区较近果园的防控措施，开展传播介体调查，加强苗木流通检疫，进行脱植原体苗木培育等。

据报道，有6种不同的植原体导致樱桃感病，根据其16 Sr RNA基因序列的RFLP分析，这些已知的樱桃植原体属于5个不同的核糖体群，即16 Sr Ⅰ、16 Sr Ⅲ、16 Sr Ⅴ、16 Sr Ⅹ和 16 Sr Ⅻ[16]。目前，四川及山东泰安、重庆等地的樱桃黄化、花变绿、花变叶植株内检测到了16 Sr V-B亚组植原体[17-19]，同时在山东烟台采集到的表现花变绿症状的樱桃上还检测到了16 Sr I-B亚组植原体[20]。16 Sr V-B亚组植原体主要发生在亚洲[21]，该亚组植原体在我国普遍出现，是枣疯病、杏退绿卷叶病、紫花苜蓿丛枝病等病害的致病源。感染樱桃的植原体类型多样，在美国发现有16 Sr Ⅲ组[22]，立陶宛发生的酸樱桃黄化植原体属于16 Sr Ⅰ组[23]，捷克发现有16 Sr Ⅹ组[24]，保加利亚发现有16 Sr Ⅻ组[25]，伊朗发现有16 Sr Ⅱ组[26]。本研究通过对获得的植原体序列进行分析，发现获得的2条序列都属于16 Sr Ⅴ组，其中GZ-1植原体序列属于16 Sr V-B亚组成员， GZ-2序列为16 Sr Ⅴ组新的亚组，表明目前感染贵州樱桃的植原体与国内其他区域基本一致，通过确定贵州樱桃植原体病害的分类学地位，对其病害传播追溯、防控有重要意义。