LC-MS/MS法检测樱桃和土壤中抗灰霉病农药残留

周 冰， 安国荣， 朱 琳， 阎 娥

(1.青海省地质矿产测试应用中心，青海 西宁 810000; 2.青海师范大学，青海 西宁 810000)

0 引 言

樱桃是我国营养价值很高的特色水果之一。它属于蔷薇科樱桃属落叶果树，因含有微量维生素B族、C族及钙、磷等元素，具有极高的食用价值[1]。果农在栽培樱桃树时存在成活率偏低，容易受到病原菌侵害的问题，果实显得稀少而珍贵。加上，市场需求量巨大，果农对樱桃树栽种面积日益扩大，而樱桃树的根癌病却限制了其高产。迄今为止，运用化学杀菌剂防治灰霉病仍然是生产中最主要的手段之一，其具有效果快速、成本低廉等优点，易使果农种植产生使用依赖性，存在滥混滥用，造成农药残留问题[2-3]。灰霉病防治使用的现代杀菌剂种类非常多，大致概括为七大类：苯并咪唑类，其代表有多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵、苯菌灵；N-苯基氨基甲酸酯类，其代表有乙霉威；二甲酰亚胺类，主要代表有异菌脲；苯胺基嘧啶类，代表有嘧霉胺、嘧菌环胺等；异噁唑啉类，代表有啶菌噁唑、丁吡吗啉和丁香菌酯等；甲氧基丙烯酸酯类，主要代表有嘧菌酯；琥珀酸脱氢酶抑制剂代表有氟吡菌酰胺、吡噻酰胺等[4-6]。啶菌噁唑对番茄灰霉病毒、叶霉病菌等具有很强的抑制作用以及植物预防、治疗活性和内吸、传导的作用，主要表现为抑制灰霉病菌的孢子萌发、菌丝生长及芽管伸长，其具有广谱和突出的离体杀菌活性被广泛应用。然而，肆意使用现代农药不仅对土壤和水源造成污染，也会间接影响包括人类在内的非靶标生物[7-10]。Wei[11]等通过研究检测土壤中的有机氯农药残留物，发现该农药残留物可以在不同的田间相互转移，进一步研究发现有机氯农药竟然可以在土壤中残留 25年之久。因此，为了保障农作物的安全必须开展土壤环境中的农药残留监测 [12]。

目前，对于这几种农药残留的检测，相关研究主要还是以番茄、茄子、苹果等常规水果蔬菜为对象，以研究农药降解的半衰期，对食品检测机构对农药残留控制的支持非常有限。另外，在农药残留的检测方法研究上，大多数方法仍采用常规的气相色谱、液相色谱等，其检测限一般较高，无法真正满足食品检测监控的需求[13]。涉及同时检测土壤和种植果蔬中残留的方法报道非常少，两者同时作为研究对象，不仅能够有效监控土壤中农药的残留，指导合理用药，而且可以进一步保障农产品的质量控制。因此，开发出灵敏、高效的多组分农药残留分析方法，来检测土壤和本体中这些化合物的实际残留水平成为十分迫切的需求。本研究旨在建立一种抗灰霉病农药在樱桃和土壤中的残留分析方法，为农产品农药残留检测提供保障，也为其他种类的农药在土壤环境中的检测分析方法开发提供借鉴[14]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-串联四极杆液质联用仪（美国AB-SCIEX公司，SCIEX-4500TRAP）；液相色谱柱（资生堂公司，CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18，100 mm×2.0 mm，3 μm）；可变速高速旋转粉碎机（北京飞驰科学仪器有限公司，PULVERISETTE 14）；均浆机（艾卡（广州）仪器设备有限公司，T25）；紫外分光光度计（上海让奇仪器有限公司 UV1900）；高速冷冻离心机（美国THERMO公司，TJ-140）；高真空旋转蒸发仪（瑞士 BUCHI公司，R-300）；MCX 固相萃取柱（华谱生物，HPSW C18-6 mL）。

啶菌噁唑（≥99.0%）、乙霉威（≥98.0%）、噻菌灵（≥98.0%）、嘧菌酯（≥99.0%）标准品购自美国Sigma；色谱纯乙腈，购自阿拉丁试剂公司；分析纯乙腈、甲醇、甲酸溶剂购自麦克林试剂公司；氯化镁、无水硫酸钠均购自国药。

1.2 溶液配制

1.2.1 样品前处理

1）采样和样品制备

供试品樱桃和土壤样品采集自山东省新泰市天宝镇樱桃种植基地。从每个种植园中随机选取15个采样点，每个采样从10 cm深度挖取100 g左右的土样，置于样品袋中。土壤样品不用风干，直接过1 mm筛后，于4 ℃保存，备用。樱桃采集自不同的树苗，取出内核后，将果肉切成小段,匀浆后，取 400 g 左右样品装入玻璃瓶中，于4 ℃保存，备用。

2）提取

分别称取5 g均质后的樱桃和过筛后的土壤样品于 100 mL聚乙烯塑料离心管中，加入5 mL纯净水搅拌均匀，充分混合，加入15 mL的乙腈进行振荡后待静置分层。然后依次加入 1.5 g无水硫酸钠和1.5 g氯化镁，盐析振荡5 min，用管式离心机在8 000 r/min下离心5 min；移液枪移取上清液到100 mL 容量瓶中，用分析乙腈定容至 100 mL，备用。

3）净化

依次流加 5 mL 乙醇和5 mL 高纯水在MCX固相萃取柱中进行充分活化。然后移取5 mL上清液过柱，再依次用 5 mL 高纯水和5 mL 乙醇洗涤,真空抽干后，用 20 mL 5%氨水乙醇溶液进行洗脱。洗脱液收集于单口瓶中，使用旋转蒸发仪于40 ℃下旋转蒸发至干，加入约2 mL 的乙腈：0.2% 甲酸铵溶液 (8∶2,V∶V)振荡溶解 2 min，然后用针筒过0.22 μm 有机系滤膜，收集待检。

1.2.2 标准溶液配制

分别称取各标准品适量，用乙腈溶解；置于100 mL棕色容量瓶中，配成1 mg/L标准品母液，备用。使用时将4种母液按比例用乙腈稀释，分别制得 8个浓度梯度（0.000 1，0.000 2，0.000 5，0.001 0，0.002 0，0.003 0，0.005 0，0.010 0 mg/L）的标准溶液，用锡箔纸包裹，于–18 ℃避光保存。

1.3 仪器条件

1）液相条件：

CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18色谱柱 (100 mm×2.0 mm,3 μm)；柱温为 45 ℃；样品室温度为 10 ℃；流量 0.2 mL/min；进样量 5 μL；采用梯度洗脱方式，条件为 0 min，90% A，10% B；3 min，50% A，50% B；4 min，20% A， 80% B；5 min，90% A，10% B；6 min，100% A，0% B。A代表0.2%甲酸溶液，B代表乙腈。

2）质谱条件

离子源为电喷雾（ESI）；采用电压为 4.5 kV的正离子模式；离子源为 148 ℃；干燥气采用氮气，气体流量为 800 L/h；温度设定为600 ℃；碰撞气采用氩气，真空为 2.5×10–4kPa。

1.4 实验设计

本研究分别考察高效液相色谱-串联质谱检测参数条件、样品提取条件、净化剂的选择条件等对分析方法的影响，然后进行方法学确认包括检测线性范围、相关系数和检测限确认和回收率、精密度，最终以真实样品进行定量检测以确定方法的可行性。

2 结果与讨论

2.1 检测条件优化

由于啶菌噁唑、乙霉威、噻菌灵、嘧菌酯的极性差异性，它们对色谱柱和流动相具有选择性，分别以 Accucore™ Vanquish™ C18+色谱柱 (100 mm×2.0 mm,3 μm)和 CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18 色谱柱(100 mm×2.0 mm,3 μm)比较考察对4种农药的选择性影响，结果发现在相同色谱条件下，4种农药在Accucore™ Vanquish™ C18+色谱柱上无法实现完全分离，并且嘧菌酯峰型有严重拖尾现象。而在CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18色谱柱上4种农药均可以保留，实现完全分离。且啶菌噁唑在CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18色谱柱相比 Accucore™ Vanquish™C18+色谱柱上的峰型有更好的对称度，因此，确定CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18作为分离色谱柱。

本实验分别使用乙腈、甲醇、乙腈–0.2%甲酸、甲醇–0.2%甲酸4种溶液筛选流动相条件，而梯度洗脱条件相同。结果发现，加入甲酸的混合流动相组，峰型明显更为尖锐，说明加入微量甲酸可以起到改善峰型和待测物组分的离子化的作用，待测物组分的响应值明显更高。洗脱溶剂选择方面，流动相甲醇相较于乙腈，洗脱效果要差些，各待测物峰型较差且出峰时间延后。因此，以乙腈–0.2%甲酸水溶液作为流动相是更好的选择。优化后的色谱图见图1、图2。通过对样品的正、负离子模式下的母离子全扫描，我们发现正离子模式下的全扫描有更高的响应值，各峰型参数见表1。因此，确定在正离子模式进行扫描得到目标物的分子离子峰，然后，以一定能量的气体撞击母离子，全扫描后得到二级离子，选取适合检测的二级离子作为定性和定量的离子分析。最后，优化去簇电压和碰撞能量，获得质谱参数。优化后的4种农药的质谱参数结果见表2。可以看出 4种农药色谱峰峰形较好，各峰型间的分离度均大于1.5。

图1 4种农药残留在土壤中的典型TIC图

图2 4种农药残留在樱桃中的典型TIC图

表1 4种农药色谱数据表

表2 4种农药的质谱参数1）

2.2 提取条件优化

通过查阅文献[15]，参考样品前处理条件，本实验分别对比了甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃溶剂对提取效果的影响，结果见表3。实验结果表明，甲醇和乙腈提取效果没有明显的差异，均能满足残留分析的要求，啶菌噁唑和噻菌灵使用乙腈的提取回收率稍高于甲醇，而使用丙酮和四氢呋喃提取液有一定的浑浊，对4种农药残留分析有一定的影响，回收率均低于80%。通过对4种溶剂的极性比对发现，乙腈＞甲醇＞丙酮＞四氢呋喃，根据极性相似相溶原理，判断这4种农药极性与乙腈最为接近，因此，乙腈是最为理想的提取溶剂。

表3 不同提取溶剂对回收率的影响

2.3 净化剂优化

净化剂能够有效去除脂肪酸、有机酸和一些极性色素及糖类，甚至是一些极性成分也能够有效去除。本实验分别选用净化剂N-丙基乙二胺、弗罗里硅土及石墨化炭黑对净化效果的影响。农药检测回收率影响结果见图3和图4。不同净化剂对检测信噪比影响结果见图5。

图3 不同净化方式对樱桃回收率的影响

图4 不同净化方式对土壤回收率的影响

图5 不同净化方式对樱桃农药残留信噪比的影响

分别采用三种不同的净化剂处理，经过处理后明显发现上清液澄清，说明采用三种净化剂处理都能够有效地去除色素，通过回收率验证，樱桃和土壤中4种农药的残留回收率在94%～109%，说明均能满足检测的需要，各组间的回收率差异性不大。通过信噪比可以间接地反映检测的灵敏度，其中弗罗里硅土和N-丙基乙二胺相对信噪比更高，说明在液相中有更高的响应值，检测灵敏度更高，从经济性上考虑，选择弗罗里硅土作为净化剂更为合适。

2.4 方法的线性范围、相关系数和检测限

通过配置不同浓度梯度的标准溶液进样得到的标准曲线来评估方法的线性范围及其相关性。以信噪比S/N=3 计算检出限，不同标准曲线的线性回归参数见表4。

表4 4种农药的检测线性参数

从表4可以看出，4种农药在 0.000 1～0.001 0 mg/L浓度范围内，本方法的线性回归系数r2均大于0.993，说明在该范围内线性关系良好，能满足检测要求。啶菌噁唑检测限最低，优于其他3个农药1～2个数量级，说明其检测响应值最高，能得到更为精密的检测结果。在该检测范围内，对4种农药残留的检测限均达到了纳克级别，均能够满足食品检测标准需要。

2.5 回收率和精密度

为了满足不同浓度下4种农药的检测的需求，分别以樱桃和土壤样品为基质,在 0.000 1，0.001 0，0.010 0 mg/kg 3 个浓度梯度水平下进行加标回收率验证,结果如表5 所示。

表5 4种农药在樱桃及土壤中加标回收率验证（n=3）

结果表明，4种农药检测的平均回收率为82.44%～104.54%，相对标准偏差（RSD）为 2.19%～4.92%，结果在标准要求范围内。当浓度0.000 1 mg/kg＜C≤0.0010 mg/kg时，回收率均在82.44%～99.43%之间，相对标准偏差≤4.33%，当浓度0.001 0 mg/kg＜C≤0.010 0 mg/kg时，回收率均在87.37%～104.54%之间，相对标准偏差≤4.92%。因此，该检测方法准确可靠，适用于樱桃及其土壤中啶菌噁唑等残留分析。

2.6 实际样品定量分析

分别采集樱桃种植基地的樱桃和土壤样品10份，分别稀释至检测浓度范围，按照1.2.1样品前处理后，分别检测，检测结果见表6。

表6 实际样品检测结果

从采集样品的检测数据来看，樱桃中残留的啶菌噁唑等4种农药均低于正常要求的控制限度（0.5 μg/kg），说明产品农药残留达到质量控制要求。另外，产品樱桃中的农药残留量总体上要低于土壤中的农药残留量。本方法对啶菌噁唑和噻菌灵有较高的检测灵敏度，尽管樱桃中噻菌灵和啶菌噁唑残留量分别为 0.16 μg/kg和 0.08 μg/kg，但土壤中噻菌灵和啶菌噁唑残留量较高，分别达到了9.47 μg/kg和13.42 μg/kg，说明这两种物质不容易分解，长期喷洒后会造成在土壤累计，存在一定的安全隐患。需要加强监管，要求其降低农药的使用量。国家在对啶菌噁唑类农药使用剂量规范上需要建立2套使用控制标准，以符合环境控制要求。

3 结束语

本研究建立LC-MS/MS联用技术，可以用来检测水果及土壤中啶菌噁唑等农药残留，并完成了方法学验证。该方法具有良好的专一性，广泛的线性，运行时间短，定量限低，可以为特殊高品质农产品的质量监控提供方法参考，为农产品的安全用药提供双重保障，解决了传统的单一检测产品农药残留或监控滞后造成土壤污染的问题，是一种适合推广的农残监测方法。本分析方法可以适用在灰霉病防治农药残留的检测，我们知道在现如今病虫害多发的环境中，复合农药的使用增加了国家监测的负担，在本研究中的分析方法并未对常规农药如氟吡菌酰胺、吡噻酰胺等的检测开展相关工作，对于国家关注的拟除虫菊酯、有机氯等农药残留检测上的适用性也有待进一步确认。