弥漫大B细胞淋巴瘤患者血清VEGF和IL-17水平变化的临床实验研究*

毛红华 张可尔 张 辉 孙建群 刘炎华 胡 娜 张志敏

湖南省邵阳市中心医院肿瘤科 422000

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)属于一种具有高度侵袭性的淋巴造血系统恶性肿瘤，是非霍奇金淋巴瘤中较为常见的一种类型，此种肿瘤在临床特征表现、流行病学以及预后等方面具有高度异质性，发病率较高[1-2]。临床上对于DLBCL的治疗多采用CHOP标准化疗方案进行治疗，此种化疗方案治疗效果较为理想，可延长患者生存周期，但仍有部分患者经此方案化疗失败或者再次复发，2次治疗效果并不理想[3]。目前多采用国际预后指数(IPI评分)对DLBCL患者临床疗效和预后情况进行评价，虽然可在一定程度上评估患者临床疗效和预后情况，但并不能做到对所有患者准确评估[4]。因此寻找准确评估患者临床疗效的敏感指标，对患者疾病严重程度、临床治疗、预后评估具有重要的意义，在本文中分析DLBCL患者血清VEGF和IL-17水平变化，为临床上此病的诊治提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年7月—2020年8月初治弥漫大B细胞淋巴瘤患者60例作为DLBCL组，其中男35例，女25例，年龄35～75岁，平均年龄(55.0±16.0)岁，采用Ann Arbor/Cotswords分期系统对患者进行分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期19例，Ⅲ期18例，Ⅳ期11例；参照国际预后指数(IPI评分)对患者进行预后危险分层：低危(0～1分)12例，低中危(2分)20例，高中危(3分)19例，高危(4～5分)9例。另外同期选取于我院健康体检中心体检的健康志愿者20例作为健康对照组，其中男11例，女9例，年龄38～74岁，平均年龄(56.0±14.4)岁。两组性别比例、平均年龄等基线资料对比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本次研究所有研究对象及家属均知情，且签署了知情同意书。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①DLBCL组患者均经组织病理学检查确诊，并完善实验室、影像学等检查，就诊前均未接受任何化疗等治疗；②健康对照组身体健康，无疾病。(2)排除标准：①排除合并自身免疫性疾病者；②排除合并哮喘、COPD、肺炎及其他心肺病变者；③排除合并其他部位恶性肿瘤者；④排除凝血功能异常者；⑤排除预计生存期<3个月者；⑥排除肝、肾等重要障碍不全者；⑦排除精神障碍、交流障碍者。

1.3 方法

1.3.1 样本采集：抽取DLBCL组治疗前、健康对照组清晨空腹静脉血3ml，以离心半径5cm、转速3 000r/min离心处理10min，分离上层血清，-80℃保存待检。

1.3.2 血清VEGF水平检测：采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清VEGF水平。将血清样本置于室温后，取出试剂盒，标记酶标板，制作标准品，以1∶2的稀释液稀释样品；在反应孔上依次加入稀释好的待测血清及标准品100μl/孔，放置37℃恒温孵育箱中湿育2h；用专用洗涤液将反应板清洗3次后，加入抗体工作液(1∶100倍稀释后)100μl/孔，置于37℃恒温孵育箱中湿育45min；继续清洗反应板4次后，在反应孔内加入TMB溶液100μl/孔，置于37℃恒温孵育箱中湿育45min后在反应孔内加入终止液100μl/孔以终止反应，在450nm波长(参考波长570～630nm)测定吸光度，颜色反应深浅与VEGF水平成正比，经绘制标准曲线计算VEGF水平。

1.3.3 血清IL-17水平检测：采用流式细胞术检测血清IL-17水平。(1)标准品制备：①将冻干细胞因子标准球加入至15ml离心管中，标为最高浓度标准品(5000 pg/ml)。②在标准品中加入2ml稀释液做稀释处理，在室温下平衡处理15min，之后将标准品混合均匀。③取9支12×75mm的流式管标记稀释倍数，分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256，在每管中加入300μl Assay Diluent稀释液。④梯度稀释标准品：从最高浓度比例管开始逐个加入300μl倍比稀释液，从最高浓度比例管开始逐个取300μl溶液至下一管，吹打均匀，直至最后一管，最后在流式管中加入300μl稀释液作为阴性对照管(0pg/ml)。(2)混合细胞因子捕捉微球：①微球混合：试验样本数包含8个检测样本、1个阴性对照以及9个标准品，在混合前每种捕捉微球充分涡旋15s，按照10μl/样本吸收适量的捕捉微球，将所有微球加入至1支流式管中，充分涡旋，混合均匀。②微球重悬：在温度为37℃下降混合完毕的微球离心处理5min，取上清液，加入与混合完毕的微球质量相同的血清增强液，混合均匀，在避光、室温下孵育30min。(3)样本孵育：将重悬后的微球充分涡旋，取50μl加入各实验管中，将50μl梯度稀释后的标准品加入至各标准品管中，将50μl待测血清加入至各样本管中，各实验管中加入50μl PE标记的IL-17检测抗体，在避光、室温下孵育3h。(4)上机检测：将1ml洗液加入至各流式管中以做样本清洗处理，在200g下离心5min，吸去上清液，在各实验管中加300ml洗液，重悬细胞，上机检测。(5)数据分析：上述操作完成后采用FCAP Array v1.0软件分析IL-17水平。

1.3.4 治疗方法：所有初治DLBCL患者均依据2019中国临床肿瘤学会(CSCO)指南弥漫大B细胞淋巴瘤指南更新要点中RCHOP治疗方案进行治疗，治疗后(2个疗程)抽取患者清晨空腹静脉血，分离血清，检测血清VEGF和IL-17水平，检测方法同1.3.2、1.3.3。

2 结果

2.1 健康对照组与DLBCL组血清VEGF和IL-17表达水平比较 如表1所示，DLBCL组血清VEGF表达水平高于健康对照组，血清IL-17水平低于健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 健康对照组与DLBCL组血清VEGF和IL-17表达水平比较

2.2 不同分期DLBCL患者血清VEGF和IL-17表达水平比较 如表2所示，Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期DLBCL患者血清VEGF水平高于Ⅰ期，血清IL-17水平低于Ⅰ期，差异具有统计学意义(P<0.05)。Ⅲ期、Ⅳ期DLBCL患者血清VEGF水平高于Ⅱ期，血清IL-17水平低于Ⅱ期，差异具有统计学意义(P<0.05)。Ⅳ期DLBCL患者血清VEGF水平高于Ⅲ期，血清IL-17水平低于Ⅲ期，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 不同分期DLBCL患者血清VEGF和IL-17表达水平比较

2.3 不同预后危险分层DLBCL患者血清VEGF和IL-17表达水平比较 如表3所示，低中危、高中危、高危DLBCL患者血清VEGF水平高于低危，血清IL-17水平低于低危，差异具有统计学意义(P<0.05)。高中危、高危DLBCL患者血清VEGF水平高于低中危，血清IL-17水平低于低中危，差异具有统计学意义(P<0.05)。高危DLBCL患者血清VEGF水平高于高中危，血清IL-17水平低于高中危，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 不同预后危险分层DLBCL患者血清VEGF和IL-17表达水平比较

2.4 DLBCL患者治疗前后血清VEGF和IL-17表达水平比较 如表4所示，DLBCL患者治疗后血清VEGF水平低于治疗前，血清IL-17水平高于治疗前，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表4 DLBCL患者治疗前后血清VEGF和IL-17表达水平比较

2.5 VEGF、IL-17之间相关性分析 如图1所示，VEGF、IL-17之间相关性采用相关性Pearson相关性分析，VEGF、IL-17之间呈负相关(r=-0.343，P=0.007)。

图1 VEGF、IL-17之间相关性分析

3 讨论

恶性淋巴瘤属来源于淋巴结、淋巴结外部位淋巴组织的一组免疫细胞肿瘤，经彩色多普勒超声检查可见肿瘤组织存在较为丰富的血流信号，具有较为广泛的浸润组织器官的疾病特点，DLBCL为非霍奇金淋巴瘤中的常见类型，我国此种肿瘤的发病率较高，严重威胁着患者的生命安全[5-6]。DLBCL的发生与多因素共同作用相关，目前对于DLBCL的发病机制尚不完全明确，但多数研究认为此种肿瘤与多数细胞因子异常表达相关，因此在本文研究中对VEGF、IL-17在DLBCL患者中的水平变化进行分析，以期望寻找特异性诊治DLBCL的敏感指标。

恶性肿瘤的生长、转移与血管生成相关，血管内皮生长因子(VEGF)属于一种作用较强的促血管生成因子，可调节肿瘤微血管形成，在淋巴管、血管生成中具有较为重要的调控作用[7]。VEGF可与其自身受体特异性结合，一方面可促进内皮细胞增殖、增加血管通透性、促进血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡，另一方面可对肿瘤微环境中免疫细胞的功能进行调节，影响宿主对肿瘤的反应[8-10]。目前研究发现[11-13]，VEGF可经多途径促进肿瘤发生进展、发挥其生物学特性。(1)VEGF可经增强血管通透性，致使纤维蛋白原等血液内成分外漏，改变细胞外基质正常特性，进而促进血管生长；(2)VEGF可经释放前列腺素等物质将内皮细胞激活，促进内皮细胞生长、迁移；(3)VEGF经诱导多种酶、蛋白生成，作用并改变肿瘤局部微环境，促进内皮细胞uPA受体表达而促进内皮细胞生长、迁移；(4)VEGF将静止的内皮细胞激活后，促进其有丝分裂，参与血管生成；(5)VEGF经调节淋巴管内皮细胞与肿瘤细胞间的关系，促进淋巴内皮细胞增殖，进而诱导淋巴管生长，最终促进淋巴结转移；(6)VEGF经促进Bcl-2表达，抑制肿瘤细胞凋亡。目前临床已有研究发现，VEGF与DLBCL发生发展相关，VEGF及其受体在此病中高表达，经其受体介导信号通路进而促进肿瘤新生血管形成、肿瘤细胞增殖，促进肿瘤进展。Broséus等[14]在其研究中认为，VEGF在弥漫性大B细胞淋巴瘤中高表达，且与肿瘤中保存的免疫应答基因特征相关，可作为此类患者生存的预测因子。本文研究显示，与健康人相比，DLBCL患者血清VEGF水平显著升高，且随着疾病加重、预后危险程度加重，其高表达更为加剧，患者治疗后水平显著降低，此结果提示着，VEGF与DLBCL患者疾病加重、预后危险程度以及临床治疗相关。

淋巴瘤的发生进展与细胞周期失控、染色体易位、调控细胞增殖、凋亡的信号因子相关，临床研究发现[15]，机体抵抗肿瘤免疫重要以细胞免疫为主，其中T淋巴细胞属于较为重要的免疫细胞，其中CD4+T细胞与DLBCL相关。Th17细胞属于CD4+T细胞中的一种，具有较为独特的分化发育特性，当IL-6与TGF-β同时存在时，经调控STAT-3信号转导通路诱导CD4+细胞分化为Th17细胞，Th17细胞进一步分泌IL-17A。IL-17属于IL-17A家族成员之一，经与其家族受体特异性结合后可激活多种信号转导通路，发挥其自身生物学特性，参与机体病理变化过程。临床研究发现，IL-17在不同类型肿瘤、不同机体免疫状态下具有双向作用，一方面IL-17可抑制肿瘤细胞凋亡、转移、侵袭，促进肿瘤血管生成，抑制抗肿瘤反应来发挥其致癌特性，另一方面，IL-17可募集T淋巴细胞、树突状细胞肉瘤细胞，增强NK细胞活性，经作用并活化多种信号通路激活并产生细胞毒性T细胞，进而抑制肿瘤细胞转移、侵袭、肿瘤血管生成，进而发挥其抑癌特性。目前已有多数研究发现，IL-17参与多种疾病的发生发展，包括风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病及肺癌、胃癌、DLBCL等肿瘤。本研究结果显示，与健康人相比，IL-17患者血清VEGF水平显著降低，且随着疾病加重、预后危险程度加重，其高表达更为加剧，患者治疗后水平显著升高，此结果提示着，IL-17与DLBCL患者疾病加重、预后危险程度以及临床治疗相关。

目前已有研究发现，在部分肿瘤中IL-17通过调节VEGF的表达，促进肿瘤发生发展。在本文中分析VEGF、IL-17在DLBCL中的表达相关性，结果显示，两者表现为负相关，此结果提示两者可能负性调节，促进DLBCL发生发展。

综上所述，DLBCL患者血清VEGF升高，IL-17水平降低，且与患者疾病严重程度、临床治疗、预后相关，可作为诊治DLBCL的敏感指标，为临床上判断DLBCL患者预后及新型免疫治疗奠定基础。